보고서 정보
주관연구기관 |
원광대학교 산학협력단 |
연구책임자 |
최경희
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2012-05 |
과제시작연도 |
2011 |
주관부처 |
교육과학기술부 |
연구관리전문기관 |
한국연구재단 National Research Foundation of Korea |
등록번호 |
TRKO201300018092 |
과제고유번호 |
1345153054 |
사업명 |
신진연구지원사업 |
DB 구축일자 |
2013-08-26
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초록
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불포화지방산은 다양한 환경적인 조건에서 정상적인 세포막의 기능을 위해 매우 중요한 역할을 한다. 다른 그람음성균과는 달리, 녹농균은 혐기적인 경로인 FabAB 와 호기적인 경로인 DesA/DesB의 두 경로를 통해 불포화지방산은 합성한다. 예비연구에서 DesA1와 DesA3가 발현되지 않는 Mycobacterium의 병원성이 소멸하였으므로, 본 연구에서 불포화지방산에 관련된 유전자들과 병원성이 관련이 있는지 살펴보았다. 그 결과, desB 돌연변이에서 단백질분해효소, pyocyanin, rhamnolipid의 합성이 저해되었고, 또
불포화지방산은 다양한 환경적인 조건에서 정상적인 세포막의 기능을 위해 매우 중요한 역할을 한다. 다른 그람음성균과는 달리, 녹농균은 혐기적인 경로인 FabAB 와 호기적인 경로인 DesA/DesB의 두 경로를 통해 불포화지방산은 합성한다. 예비연구에서 DesA1와 DesA3가 발현되지 않는 Mycobacterium의 병원성이 소멸하였으므로, 본 연구에서 불포화지방산에 관련된 유전자들과 병원성이 관련이 있는지 살펴보았다. 그 결과, desB 돌연변이에서 단백질분해효소, pyocyanin, rhamnolipid의 합성이 저해되었고, 또한 swarming 및 twitching 운동성이 감소되었으며, in vivo C. elegans 감염도도 감소하였다. 그러므로, DesB는 불포화지방산 합성효소의 역할뿐 아니라, 녹농균의 병원성에도 중요한 역할을 한다는 점을 밝혀냈다. 이를 토대로 DesB의 새로운 약물 타킷으로서의 가능성을 시사할 수 있다.
fabA의 발현은 단일불포화지방산(oleic acid,OA)을 외부에서 첨가하였을때 감소되었고, 바이오필름이 형성되었을때 증가함을 보였다. 이는 fabA의 발현은 환경에 따라 변화하고, 이를 조절하는 조절인자가 있다는 점을 보여준다. P. aeruginosa, P. putida, P. syringae에서 높은 염기서열 일치도를 보여주는 부분이 fabA 유전자 upstream의 30 nt로서, 이 부분을 삭제하면 fabA 유전자 전사발현률이 상당히 감소되었고, OA에 대한 fabA 발현 감소도 소멸됨을 볼때, 이 부분이 fabA 발현 조절에 positive 역할을 수행함을 알 수 있었다. 그리고 RT- PCR 분석을 통해 fabA 유전자의 제 2의 promoter가 fabAB operon 보다 먼 upstream 부분에 존재함을 알수 있었다.
fabA 유전자의 활성인자(activator)를 규명하기 위해 유전적 방법과 생화학적 방법을 이용하여 실험을 수행하였다. 첫번째 유전적 방법으로서 다양한 후보유전자 (PA1611, PA1627, GntR계 유전자) 등을 삭제하여 비교한 결과 fabA의 활성조절인자로서의 기능은 없었다. 두번째 유전적 방법으로서, mariner-based random insertional mutagenesis를 이용한 방법을 수행한 결과, rpoN, PA4760, PA1629, PA0358, PA3649, PA4476, PA4233, desA 가 fabA 발현의 활성에 직접적인 조절인자로서가 아닌 간접적이고 복합적으로 영향을 미침을 도출하였다. 세번째 유전적 방법으로서, E. coli surrogate strain을 이용한 것으로서, 사용한 PAO1 library 중 fabA 발현증가를 보인 DNA fragment는 21개로 모두 anr을 포함하는 것들로서, anr이 fabA의 positive regulator 후보유전자로 추측되었지만, 간접적으로만 fabA regulation에 영향을 미치고 있는 것으로 보여졌다. 마지막으로 생화학적 방법들 즉, 30 bp로 구성된
biotinylation된 이중 DNA 가닥을 제조하여 Streptavidin beads와 30bp concatamer affinity chromatography 이용하여 CNBr-activated Sepharose beads에 결합하는 단백질을 분리하는 방법을 수행하였지만, 후보 조절단백질의 스크리닝은 실패하였지만, 다른 실험조건(예: biofilm 상태로 자란 환경 또는 낮은 온도 등)에서의 스크리닝이 필요할 것으로 추측된다.
그러므로, fabA의 발현조절이 조절인자에 의해서가 아니라 riboswitch와 같은 RNA의 2차 구조에 형성에 의해서 이루어질 가능성을 확인하기 위해 DINAMelt 분석을 실시하였고, 이를 통해 fabA 5' UTR 부분에 두가지 type의 secondary structure이 존재함을 알수 있었고, fabA 발현 조절은 이 두가지 secondary structure의 생성 및 소멸로 이루어지는 riboregulatory element에 의한 것임을 추측할수 있었다.
결론적으로, fabAB의 발현은 두 개의 promoter (P1 와 P2)에 의해 활성화되고, 발현량은 불포화지방산 (UFA)함량에 따라 두가지로 나눌수 있으며, 그 중 함량이 낮을때는 P1와 P2 promoter에 의해 모두 발현이 활성이 되어 불포화지방산 합성단백질 FabA와 FabB 모두 증가하게 되는데, 이는 riboregulatory element가 antiterminator로 전환되면서 P2 promoter가 활성되기 때문이다. 반면 UFA의 함량이 높을때 는 P1 promoter에 의해서만 fabAB 발현이 활성되어 다소 적은 양의 FabA와 FabB 단백질이 생산된다. 이는 높은 UFA의 함량으로 인해 riboregulatory element가 terminator로 전환되어 P2 promoter에 의한 발현이 소멸되기 때문으로 추측된다.
목차 Contents
- 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
- 목차 ... 3
- I. 연구결과 요약문 ... 4
- II. 연구내용 및 결과 ... 5
- 1. 연구과제의 개요 ... 5
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 5
- 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 7
- 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 13
- 5. 연구결과의 활용계획 ... 14
- 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 14
- III. 연구성과 ... 16
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