초록 ▼

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
- 칼슘대사네트워크 구성인자 중 calsequestrin 2와 junctin의 세포내 발현비율에 따른 calsequestrin 2 중합체의 변화를 연구한다.
- 심장질환 중 하나인 카테콜아민성 다형 심실빈맥 (CPVT)의 원인이라고 알려진 calsequestrin 2 mutant의 연구를 통해 CPVT의 심층적 연구를 수행한다.
- 위탁과제를 통해 확보한 IP3 receptor knock-down 근원세포주의 미분화현상을 관찰하고 미분화원인을 규명하기 위한 연구를 수행한다.
- 심

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
- 칼슘대사네트워크 구성인자 중 calsequestrin 2와 junctin의 세포내 발현비율에 따른 calsequestrin 2 중합체의 변화를 연구한다.
- 심장질환 중 하나인 카테콜아민성 다형 심실빈맥 (CPVT)의 원인이라고 알려진 calsequestrin 2 mutant의 연구를 통해 CPVT의 심층적 연구를 수행한다.
- 위탁과제를 통해 확보한 IP3 receptor knock-down 근원세포주의 미분화현상을 관찰하고 미분화원인을 규명하기 위한 연구를 수행한다.
- 심혈관계 연구를 위해 필수적인 심근세포주의 부재로 인해 관련 연구의 수행에 많은 어려움이 존재한다. 본 연구에서는 이를 해결하기 위해 전단계 연구에서 구축한 neonatal mouse heart로의 유전자전달 기술을 이용하여 세포의 immortalization을 유도하기 위한 유전자전달을 통하여 mouse cardiomyocyte cell line을 구축하고자 하였다.
- 만약 mouse cardiomyocyte cell line 구축이 성공한다면, 이 세포주를 대상으로 전단계에서 스크리닝된 심근세포 칼슘대사 관련 유전자의 knock-down을 유도시킨 세포주들을 구축하여 시스템 사업단 연구자들에게 공급하고자 하였다.
- 또한, 심근세포 칼슘대사시스템연구는 특성 상, primary cardiac myocyte와 동물모델의 심근을 대상으로, 스크리닝된 관련 유전자들의 발현을 제어 (과발현 및 발현억제:over-expression and gene silencing) 해야만 한다. 이러한 배경에서 본 연구과제에서는 전단계에서 구축한 neonatal mouse heart로의 유전자전달 기술을 이용하여 심근세포 소포체의 칼슘대사 구성인자들을 대상으로 세포 수준에서 수행한 knock-down 실험에서
RNA 간섭에 의한 발현 제어가 확인된 유전자들의 functional genomic study를 동물모델(heart) 수준에서 수행하기 위한 RNAi용 렌티바이러스 유전자 발현 제어 기술을 이용한 knock-down mouse model를 생산하여 시스템 사업단 연구자들에게 공급하고자 하였다.
- 이렇게 생산된 칼슘채널 knock-down mouse들은 본 연구사업단 연구진들에 의한 유전체, 단백체, 신호전달, 칼슘 imaging 등의 연구기법을 이용한 in vivo 기능유전체학 연구를 통해 칼슘대사-심근비대 모델을 확립하고 관련 질환의 예방 및 치료방법을 개발하는 데 기여를 하게 될 것이다.

Abstract ▼

Calsequestrin (CSQ), the major intrasarcoplasmic reticulum calcium storage protein, undergoes dynamic polymerization and depolymerization in a Ca²⁺-dependent manner. However, no direct evidence of calsequestrin depolymerization in vivo with physiological relevance has been obtained. In th

Calsequestrin (CSQ), the major intrasarcoplasmic reticulum calcium storage protein, undergoes dynamic polymerization and depolymerization in a Ca²⁺-dependent manner. However, no direct evidence of calsequestrin depolymerization in vivo with physiological relevance has been obtained. In the present study, live cell imaging analysis facilitated characterization of the in vivo dynamics of the macromolecular calsequestrin structure. calsequestrin 2 appeared as speckles in the presence of normal arcoplasmic reticulum (SR) Ca²⁺ that were decondensed upon Ca²⁺ depletion. Moreover, calsequestrin 2 decondensation occurred only in the stoichiometric presence of junctin (JNT). When expressed alone, calsequestrin 2 speckles remained unchanged, even after Ca²⁺ depletion. FRET analysis revealed constant interactions between calsequestrin 2 and JNT, regardless of the SR Ca²⁺ concentration, implying that JNT is an essential component of the calsequestrin 2 scaffold. In vitro solubility assay, electron microscopy, and atomic force microscopy studies using purified recombinant proteins confirmed Ca²⁺ and JNT-dependent disassembly of the calsequestrin 2 polymer. Accordingly, we conclude that reversible polymerization and depolymerization of calsequestrin 2 are critical in SR Ca²⁺ homeostasis.
We constructed 7 shRNA-encoding lentiviral and AAV9 vectors targeting calcium channel-related genes (PP1, PKA, vdac2, calsequestrin2, IP3R1, calcineurin, JTT) expressed in mouse cardiomyocytes. A couple of cell type (HL-1, 293, HeLa, NIH/3T3,
C2C12, and primary mouse neonatal cardiomyocytes) were examined for the validation of RNAi effect with shRNA-encoding lentivirus/AAV9 vectors. Animal models are an essential phase in the study of the functions of calcium channel-related genes. We
found that retro-orbital plexus injection with lentiviral/AAV9 vectors showed higher transduction efficiency. These knock-down animal model technology was used for making animal model in this study.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 보고서 요약서 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 8
• 목차 ... 9
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 10
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 11
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 13
• Calsequestrin 2 (CSQ2) 중합체의 구조적 변화의 정량화 ... 13
• 심장질환인 CPVT와 관련한 calsequestrin 2 mutant에 대한 연구 ... 14
• IP3 receptor knock-down 근원세포주의 미분화 원인 규명에 대한 연구 ... 15
• 심근세포 칼슘조절 유전자발현 제어용 AAV9 벡터의 제조 및 생산 ... 18
• 심근세포 칼슘조절 유전자발현 제어용 AAV9 바이러스 생산 및 정량 ... 22
• Mouse heart에서 심근세포 칼슘조절 유전자발현 제어조사 ... 23
• Mouse heart를 표적으로 하는 AAV9 바이러스의 retroorbital injection과 확인 ... 26
• Mouse heart를 표적으로 하는 AAV9 바이러스의 tail vein injection과 확인 ... 28
• Mouse heart 주입용 렌티바이러스 벡터의 생산 및 정제 ... 29
• Bmi-1과 TERT gene 발현 렌티바이러스 벡터 구축 ... 30
• Human Bmi-1 발현확인 ... 31
• One day post-neonatal mouse cardiomyocytes 분리 및 배양 ... 32
• Lentiviral infection into neonatal mouse primary cardiomyocytes ... 33
• Isolation and Establishment of immortalezed mouse cardiomyocyte clonal cell line ... 34
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 35
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 36
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 37
• 제7장 참고문헌 ... 38