초록 ▼

연구목표:
본 연구의 궁극적인 목표는 구조생물학적 연구를 통하여 FKBP-12 의 IP3 및 Ryanodine 수용체에 대한 결합 및 조절 기전을 명확히 밝히는 것이다. 현재 이들 단백질 간의 상호작용 및 조절에 관하여 다수의 분자-세포 생물학적 논문들이 나와 있지만 결합부위 및 sub-type 간의 차이에 대해 상충하는 결과를 보여주고 있어 새로이 구조생물학적인 접근 방법이 필요하다. 특히 본 연구에서는 구조생물학 분야의 대표적 방법인 NMR과 X-ray crystallography 를 같이 병행하여 연구의 성공가능성을 높이

연구목표:
본 연구의 궁극적인 목표는 구조생물학적 연구를 통하여 FKBP-12 의 IP3 및 Ryanodine 수용체에 대한 결합 및 조절 기전을 명확히 밝히는 것이다. 현재 이들 단백질 간의 상호작용 및 조절에 관하여 다수의 분자-세포 생물학적 논문들이 나와 있지만 결합부위 및 sub-type 간의 차이에 대해 상충하는 결과를 보여주고 있어 새로이 구조생물학적인 접근 방법이 필요하다. 특히 본 연구에서는 구조생물학 분야의 대표적 방법인 NMR과 X-ray crystallography 를 같이 병행하여 연구의 성공가능성을 높이고자 하였다.
연구내용:
1차년도에는 FKBP-12 와 IP3 및 Ryanodine 수용체의 결합도메인을 대량분리하였다. 이를 위하여 FKBP-12 와 IP3 및 Ryanodine 수용체 여러sub-type의 결합도메인을 다수의 fusion vector 에 클로닝하고 최적의 구조데이터를 얻을 수 있는 용액조건을 확립했으며, 또한 동위원소로 치환된 단백질을 대량 순수 분리를 진행하였다.
2차년도에는 대상 단백질에 대한 결합실험과 NMR 데이터 획득 및 분석을 진행하였다. pulldown assay를 통하여 FKBP-12와 IP3 및 Ryanodine sub-type 간의 결합을 확인하였고 NMR 데이터를 획득하여 backbone 및 side chain assignment 를 수행하였고 결합 부위를 동정하였으며 NMR titration 실험을 통하여 결합 강도를 알아 내였다. X-ray 분석을 위한 crystallization을 시도하였지만 결과가 좋지 않아 NMR로 구조분석을 진행하였다.
3차년도에는 복합체의 구조 결정 및 생화학적 실험을 수행 하였다. FK506과의 경쟁 실험을 진행 하였고, 결합 부위에 대한 검증을 완료하였으며 simulated annealing 방법을 이용해 단백질 복합체의 구조를 얻고 그 결합 양상 및 조절기전을 밝혔다.
기대효과:
세포의 거의 모든 기능에 영향을 미치는 칼슘조절기전을 이해하는데 도움을 줌으로써 기초 과학인 세포-분자 생물학 뿐만 아니라 임상연구진과의 협동연구를 통하여 칼슘 통로의 돌연변이 및 칼슘 조절 이상으로 발생하는 많은 질병의 기전 및 치료법 개발에 기여할 것이다. 또한 구조생물학분야의 대표적인 접근방식인 NMR를 이용하므로 다른 단백질의 연구에 있어서도 성공가능성을 높일수 있는 실험적 모델이 될 것으로 여겨진다. 그리고 연구인력 양성 측면에서도 구조생물학, 및 생화학적 기술을 두루 갖춘 세계적 우수 연구 인력을 양성할것으로 기대된다.

Abstract ▼

Purpose:
The ultimate goal of this project is to elucidate the binding and regulatory mechanism of interaction between FKBP-12 and IP3 and Ryanodine receptor. Currently, there are several papers on the mechanism using molecular and cellular biological approaches, but they show contradictory resul

Purpose:
The ultimate goal of this project is to elucidate the binding and regulatory mechanism of interaction between FKBP-12 and IP3 and Ryanodine receptor. Currently, there are several papers on the mechanism using molecular and cellular biological approaches, but they show contradictory results, requiring new structural biological approaches. Especially, here, we use NMR and X-ray in tandem to enhance the possibility of successful results.
Contents:
In the first year, we mass-produce the target proteins (FKBP-12, IP3R and RyR domains). For that, the binding domains of IP3R and RyR will be cloned in multiple fusion vectors and solution conditions for the optimal data collection will be established. In addition, isotope labeled purified protein were produced.
In the second year, NMR experiments, data analysis and binding experiments were carried out. For these, we applied pulldown assay to confirm the interaction between FKBP-12 and IP3 of Ryanodine sub-type, and NMR data were acquired and backbone and sidechain assignments were carried out and assigned the binding site. In addition, binding affinity was assessed through NMR titration experiments. We tried X-ray crystallization, but we failed to produce crystal, therefore we focused on NMR experiments to structure analysis.
In the third year, the structure was refined and biochemical experiments were carried out. For these, the competition pulldown assay was carried out using FK506 to confirm the binding residues. Binding aspect and mechanism were determined using simulated annealing methods.
Expected Contribution:
Calium is a universal messenger in the cell. Therefore these research will help not only understand the basic cellular and molecular biolgy of the calcium signalling, but also develop the treatment procedures for the dieseases occuring due to abnormalities in the calcium signalling. The combination of NMR and X-ray will serve as a model approach for other protein study to increase the successful outcomes. In addition, human resources with high quality research capabilities encompassing structural biology and biochemical techinques will be produced.

목차 Contents

• 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내·외 기술개발 현황 ... 5
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 8
• 5. 연구결과의 활용 계획 ... 8
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 8
• Ⅲ. 연구성과 ... 9