[보고서]맞춤형 단당류 생물전환을 위한 효소의 기질특이성 조절 기술

오덕근

맞춤형 단당류 생물전환을 위한 효소의 기질특이성 조절 기술
Modulation technology of substrate specificity of enzymes for designed bioconversion of monosaccharides 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	건국대학교 KonKuk University
연구책임자	오덕근
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2012-06
과제시작연도	2011
주관부처	교육과학기술부
사업 관리 기관	한국연구재단
등록번호	TRKO201300019680
과제고유번호	1345156325
DB 구축일자	2013-09-14
키워드	생물전환,효소구조,단당류 전환 효소,기질특이성 조절,유전자 진화,분자 모델링,단당류,단백질 공학,탄수화물 공학Bioconversion,Enzyme structure,DNA evolution,Molecular modeling,Monosaccharide-convertin genyme,Modulation of substrate specificity,Monosaccharides,Protein enginnnering,Carbohydrate engineering

초록 ▼

연구의 목적 및 내용
■ 단당류 전환 효소의 기질특이성을 조절할 수 있는 기반기술을 확보하고, 맞춤형 단당류 생물전환을 수행하는 것이 연구의 목표이다.
- 효소의 클로닝, 정제 및 기질특이성 조사
- 기질특이성에 따른 효소의 유전자 및 구조 비교 분석
- 효소 구조에 기반을 둔 분자진화, 단백질 공학 및 분자모델링에 의한 효소의 기질특이성 개량
- 유전 변이체 효소의 기질특이성 조사 및 기질특이성 조절의 기반 기술 확립
연구결과
1. 효소 유전자의 클로닝 및 기질 특이성 연구
- 발색법을 이용한 효소 활성 정량법 및 선별법 확립
- 유전자은행 및 메타게놈 정보를 이용한 목적 유전자 클로닝
- 효소 정제 및 기질 특이성 조사
2. 분자 진화기술과 단백질공학기술에 의한 효소의 기질특이성 개량
- 분자정보해석을 통한 유전자의 진화과정 및 효소의 연관정보 예측
- 분자 진화와 단백질공학기술을 이용한 유전변이체 라이브러리 개발 및 확보
- 기질특이성이 우수한 클론만을 선택적으로 선별할 수 있는 고속선별법 확립
- 기질특이성에 따른 효소의 유전자 및 구조 비교 분석
- 라이브러리에서 기질특이성이 개량된 유전변이체의 확보
3. 구조분석에 의한 효소의 기질특이성 개량
- 규명된 구조 또는 분자모델링을 이용한 효소의 구조분석
- 기질특이성 관련 아미노산 잔기들의 치환에 의한 기질특이성 변화 조사
- 구조 분석 및 분자모델링에 근거한 기질특이성의 결정인자 탐색
- 개량된 단당류 전환 효소들의 기질특이성 조사
4. 기질특이성 조절 기반기술 확립
- 단당류 전환 효소의 단당류 전환과정의 기작 규명
- 단당류 전환 효소의 기질특이성 조절 인자 결정
- 맞춤형 단당류 생물전환
연구결과의 활용계획
■ 기술 발전에의 기대효과
- 기질 특이성이 우수한 효소를 탐색하는 고전적 방법 대신 기질특이성이 넓은 효소를 목적에 따라 효소의 기질 특이성을 조절하고 활성적인 측면에서 기질특이성이 우수한 효소로 제작하는 기질특이성 조절 기반기술을 확립하게 된다면 단당류 전환 효소 관련 원천 기반 기술을 확보되고 이를 이용한 맞춤형 단당류 생산이 가능해 진다.
- BT의 효소진화기술과 NT의 효소구조 변형기술의 결합에 의해 연구되어진 기질 특이성 조절 기술을 이용하여 여러 가지 기능성 바이오 신소재 생산이 가능해진다. 이 기술은 핵심적 원천기술로 다른 효소를 이용한 바이오 기능성 신소재 개발에 광범위하게 적용된다.
■ 산업 발전에의 기대효과
- 본 연구는 단당류간의 용이한 전환을 통해 새로운 개념의 산업적 생산법이 개발되어 단당류 산업의 재편까지 가능하게 될 것으로 예상된다.
- 다양한 단당류의 확보가 가능하게 되고 단당류 및 그 유도체에 대한 기능성 연구가 추진되며 기능성 바이오 신소재 연구 및 산업의 발전을 도모할 수 있다.
- 맞춤형 효소들은 생물전환에 의한 다른 의약품이나 고가 화합물 생산에 사용될 수 있고, 생산된 단당류를 저칼로리 감미료, 당뇨병 치료제로 개발될 수 있다. 항생 및 항암제의 당을 본 연구에 의해 개발된 단당류나 그 유도체로 대체하면 새로운 항생 및 항암제가 개발될 수 있다.

Abstract ▼

Purpose& contents
Platform technology to modulate substrate specificity of enzymes for designed bioconversion of monosaccharides will be constructed.
- Cloning of enzyme genes, enzyme purification, investigation of substrate specificity
- Comparison of enzyme genes and structures with varying substrate specificity
- Improvement of substrate specificity by DNA evolution, protein engineering, and molecular modeling
- Investigation for substrate specificity of mutant enzymes and establishment of modulation technology of substrate specificity of enzymes
Result
1. Gene cloning and substrate specificity of enzymes
- Development of assay method using color detection
- Gene cloning from gene database and metagenome information
- Purification and substrate specificity of enzyme
2. Improvement of substrate specificity by DNA evolution and protein engineering
- Prediction for enzyme related information and process of DNA evolution by bioinformatics
- Construction of gene libirary by DNA evolution and protein engineering
- Establishment of HTS system to obtain a excellent enzyme for substrate specificity
- Comparison of enzyme structure and gene for substrate specificity
- Obtainment of improved mutant gene for substrate specificity from libirary
3. Improvement of substrate specificity by structure modification
- Structure analysis for determined structure and molecular modeling of enzyme
- Investigation for change of substrate specificity by substituting amino acids
- Investigation for molecular determinant of substrate specificity by structure analysis and molecular modeling
- Investigation for substrate specificity of improved enzymes
4. Establishment of modulation technology of substrate specificity of enzymes
- Determination for mechanism of monosaccharide converting process
- Establishment of modulation technology of substrate specificity
- Designed bioconversion of monosaccharides
Expected Contribution
1. Technological scope
- If modulation technology of substrate specificity of enzymes with broad specificity were constructed instead of the classical method to screen excellent enzymes for substrate specificity, designed bioconversion of monosaccharides and its platform technology would be obtained
- Various new biomaterials can be produced by using modulation technology of substrate specificity obtained from combined technology with enzyme evolution technology in BT and modification technology of enzyme structure in NT. This technology is the core platform technology, which can apply to the development of new biomaterials using enzymes.
2. Industrial scope
- New concept industrial production will be established by the easy interconversion between monosaccharides and then monosaccharides industry will be reorganized.
- Various monosaccharides will be obtained and the functional study on monosaccharides and their derivates will be started. As a result, the study and industry for functional new biomaterials will be developed.
- Designed enzymes will be used in bioconversion of other medicines and valuable compounds and monosaccharides will be used in low calorie sweetener and diabetic drug. If sugar moiety in antibiotics and anticancer medicine were replaced with rare sugar, new antibiotics and anticancer medicine would be devoloped.

목차 Contents

도약연구사업 최종보고서(제출용) ... 1
목 차 ... 2
연구계획 요약문 ... 3
연구결과 요약문 ... 4
한글요약문 ... 4
SUMMARY ... 5
연구내용 및 결과 ... 6
1. 연구개발과제의 개요 ... 6
2. 국내외 기술개발 현황 ... 11
3. 연구수행 내용 및 결과 ... 12
4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 74
5. 연구결과의 활용계획 ... 76
6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 77
7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 78
8. 참고문헌 ... 79
9. 연구성과 ... 81
10. 기타사항 ... 90

표/그림 (89)

표 단당류의 기능성 및 응용
표 단당류 생산 활성클론의 선별을 위한 스크리닝법
표 단당류 생산 활성클론의 선별을 위한 스크리닝법
표 분자진화기술에 의한 효소 활성 증가에 대한 흐름도
표 D-Glucose의 에피머화 반응
표 Sugar isomerases and their genes
표 Sugar phosphate isomerase and their genes
표 Sugar epimerases and their genes
표 Polyol dehydrogenase and their genes
표 본 연구팀이 생물전환한 D-form의 육탄당
표 eobacillus stearothermophilus, G. thermodenitrificans, Thermotoga neapolitana L-arabinose isomerase (AI)의 특성
표 Pseudomonas stutzeri, Bacillus substilis, Thermotoga martima L-rhamnose isomerase (RI)의 특성
표 Escherichia coli O157:H7, Proviencia stuartii, Serratia proteamaculans 및 Dictyoglomus turgidum lyxose isomerase (LI)의 특성
표 Caldicellulosiruptor saccharolyticus와 Dictyoglomus turgidum L-fucose isomerase (FI)의 특성
표 Clostridium difficile, Streptococcus pneumoniae, C. thermocellum 및 Thermotoga maritima Ribose 5-phosphate isomerase (RpiB)의 특성
표 Bacillus subtilis, Geobacillus thermodenitrificans 및 Thermus thermophilus mannose-6-phosphate isomerase (MPI)의 특성
표 Pyrococcus furiosus glucose-6-phosphate isomerase (GluPI) 와 Lactobacillus latis galactose-6-phosphate isomerase (GalPI)의 특성
표 Agrobacterium tumefaciens psicose-3-epimerase (PE)와 Sinorhizobium meliloti tagatose-3-epimerase (TE)의 특성
표 L-rhamnose isomerase의 단당류에 대한 기질특이성
표 Escherichia coli O157:H7, Proviencia stuartii 및 Serratia proteamaculans lyxose isomerases (LI)의 단당류에 대한 기질특이성
표 Caldicellulosiruptor saccharolyticus L-fucose isomerase의 aldose에 대한 기질특이성
표 Dictyoglomus turgidum L-fucose isomerase의 aldose에 대한 기질특이성
표 Clostridium difficile, Streptococcus pneumoniae, C. thermocellum 및 Thermotoga maritima Ribose 5-phosphate isomerase (RpiB)의 단당류에 대한 기질특이성
표 Bacillus subtilis, Geobacillus thermodenitrificans 및 Thermus thermophilus mannose-6-phosphate isomerases (MPI)의 단당류에 대한 기질특이성
표 Pyrococcus furiosus glucose-6-phosphate isomerase의 단당류에 대한 기질특이성
표 Lactobacillus latis galactose-6-phosphate isomerase (GalPI)의 특성
표 Activity of E. coli K12 arabinose-5-phosphate isomerase의 기질특이성
표 Agrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase와 Sinorhizobium meliloti D-tagatose 3-epimerase의 기질특이성
표 L-Ribulose 5-phosphate 4-epimerase의 기질특이성
표 L-Ribulose 5-phosphate 3-epimerase의 기질특이성
표 같은 -OH group 방향 탄소를 기준으로 한 isomerase의 기질특이성 분류
표 Escherichia coli O157:H7, Proviencia stuartii 및 Serratia proteamaculans D-lyxose isomerases에 의한 단당류 이성화반응의 도식.
표 B. subtilis 및 Thermotoga maritima L-rhamnose isomerases에 의한 단당류 이성화반응의 도식. 효소활성: 탄소의 오른쪽 같은 -OH group 방향 C2,3 > C2,3,4.
표 P. stutzeri L-rhamnose isomerases에 의한 단당류 two-step 이성화반응의 도식.
표 G. stearothermophilus L-arabinose isomerase에 의한 단당류 one-step 이성화반응의 도식.
표 C. saccharolyticus L-fucose isomerase에 의한 단당류 one-step 이성화반응의 도식.
표 E. coli K12 arabinose-5-phosphate isomerase에 의한 단당류 one-step 이성화반응의 도식.
표 L. latis galactose-6-phosphate isomerase에 의한 단당류 two-step 이성화반응의 도식.
표 Bacillus subtilis, Geobacillus thermodenitrificans 및 Thermus thermophilus mannose-6-phosphate isomerases에 의한 단당류 one-step 이성화반응의 도식
표 A. Thermotoga maritima ribose 5-phosphate isomerase에 의한 단당류 two-step 이성화반응의 도식. Clostridium difficile ribose 5-phosphate isomerase에 의한 단당류 two-step 이성화반응의 도식.
표 P. furiosus glucose-6-phosphate isomerase에 의한 단당류 two-step 이성화반응의 도식.
표 Agrobacterium tumefaciens psicose-3-epimerase와 Sinorhizobium meliloti tagatose-3-epimerase에 의한 ketose epimerization 반응의 도식.
표 Ribulose-5-phosphate-3-epimerase에 의한 ketose epimerization 반응의 도식.
표 Ribulose-5-phosphate-4-epimerase에 의한 ketose epimerization 반응의 도식.
표 Psicose-3-epimerase 효소 구조 A. Overall structure B. Active site structure
표 Lyxose isomerase 효소 구조 A. Overall structure B. Active site structure
표 Ribose-5-phosphate isomerase 효소 구조 A. Overall structure B. Active site structure
표 Active site 잔기에 대한 wild-type 및 돌연변이 효소의 kinetic parameters
표 Surface contact area and distance between substrate and active site residue
표 66번과 107번 잔기 치환 돌연변이 효소의 fructose와 tagatose에 대한 상대활성
표 66번과 107번 잔기 치환 돌연변이 효소의 fructose와 tagatose에 대한 kinetic parameters
표 Psicose-3-epimerase와 fructose 복합체의 0 ns(흰색)와 0.5 ns(녹색) 시간에서의 겸침영상
표 Wild-type, A107D, A107P, A107V 및 A107I 돌연변이 효소들의 열안정성 (반감기).
표 Isomerization of hydroxyl group at carbon 2 by C. thermocellum ribose 5-phosphate isomerase.
표 Predicted active site of C. difficile RpiB and T. maritima RpiB with D-ribose and L-lyxose. The ball and stick presents the substrate
표 Specific activity of wild type and mutant ribose-5-phosphate isomerase from C. difficle for L-lyxose
표 Specific activities of T. thermophilus mannose-6-phosphate isomerase wild type and mutant enzymes for mannose-6-phosphate, D-talose, L-ribose
표 정량적 96-well plate screening.
표 Specific activities of P. furiosus glucose-6-phosphate isomerase wild type and mutant enzymes for glucose-6-phosphate, L-talose, D-ribose
표 Isomerization activity of L-arabinose isomerase and its mutants.
표 Mutation effect of 164-site and 475-site on the isomerization activity
표 Mutation effect of double sites on the isomerization activity
표 Kinetic parameters of L-arabinose isomerase mutant for the galactose isomerization.
표 Mutation effect of 17-site, 90-site, 129-site on the isomerization activity.
표 Comparison for kinetics parameters of the wild-type and mutants.
표 Relative activities and half-lives of thermal inactivation at 55°C for the wild-type and mutant enzymes of D-psicose 3-epimerase from A. tumefaciens
표 Relative activities and half-lives of thermal inactivation at 55°C for the wild-type and mutant enzymes at positions 33 and 213, and I33L-S213C mutant enzyme of D-psicose 3-epimerase from A. tumefaciens
표 Kinetic parameters of the wild-type, S213C, I33L, and I33L-S213C mutant enzymes of D-psicose 3-epimerase from A. tumefaciens for fructose
표 Effect of temperature on the activities of the wild-type, S213C, I33L, and I33L-S213C mutant enzymes of D-psicose 3-epimerase from A. tumefaciens. The reactions of the wild-type (●), S213 (□), I33L (■), and I33L-S213C (○) mutant enzymes were performed in 50 mM EPPS buffer (pH 8.0) containing 20 mM fructose and 0.21 U/ml of enzyme for 10 min.
표 Thermal inactivation for the activities of the wild-type (●), S213C (□), I33L (■), and I33L-S213C (○) mutant enzymes of D-psicose 3-epimerase from A. tumefaciens at (A) 50 °C and (B) 55°C. A sample was withdrawn at each time interval and the relative activity was determined in 50 mM EPPS buffer (pH 8.0) containing 20 mM fructose and 0.21 U/ml of enzyme at 50°C for 10 min.
표 Apparent melting profiles of the wild-type (●), S213C (□), I33L (■), and I33L-S213C (○) mutant enzymes of D-psicose 3-epimerase from A. tumefaciens by differential scanning calorimeter (DSC). The maximum value of each peak indicates the apparent melting temperature.
표 Specific activities of the wild-type and alanine-substituted mutant enzymes of mannose-6-phosphate isomerases from T. thermophilus for L-ribulose.
표 Kinetic parameters and specific activities of the wild-type and mutant enzymes of mannose-6-phosphate isomerases from T. thermophilus at position 142 for L-ribulose.
표 Docking of L-ribulose into the active-site of the wild-type and mutant enzymes. The yellow, blue, red sticks represent L-ribulose as substrate and arginine and asparagine residues at position 142, respectively. The dashed line was distance between residue and substrate. The figure was produced using PYMOL.
표 Time courses of L-ribose production from L-ribulose to by the wild-type (●) and R142A mutant (○) mannose-6-phosphate isomerases from T. thermophilus. The reactions were performed in 50 mM PIPES buffer (pH 7.0) containing 10 mM L-ribulose, 70U/ml of enzyme, and 0.5 mM of each metal ion at 70°C for 70 min. Data represent the means of three experiments and error bars represent standard deviation.
표 Schematic representation of RPI, MPI, and GPI linked in pentose phosphate pathway and glycolysis metabolism. ATP, adenosine triphosphate; RPI, ribose-5-phosphate isomerase; MPI, mannose-6-phosphate isomerase; and GPI, glucose-6-phosphate isomerase.
표 Schematic diagrams of the reactions catalyzed by phosphate sugar isomerases, including CTRPI, TTMPI, and PFGPI.
표 Active sites of CTRPI, TTMPI, and PFGPI with ribose 5-phosphate, mannose 6-phosphate, and glucose 6-phosphate, respectively
표 Relative activities of the wild-type and mutant enzymes in the active site of CTRPI, TTMPI, and PFGPI for ribose-5-phosphate and L-talose, for mannose-6-phosphate and D-talose, and for glucose-6-phosphate and L-talose, respectively
표 Free energy caculation of CTRPI, TTMPI, and PFGPI.
표 Kinetic parameters of the wild-type and mutant enzymes at position 132 of CTRPI for L-talose, at position 142 of TTMPI for D-talose, and at 85 position of PFGPI for L-talose.
표 Relative activities of the mutant enzymes of CTRpiB Arg132, TTMPI Arg142, and PFGPI Thr85 for phosphate sugars and monosaccharides. The relative activities of 100% for ribose-5-phosphate and L-talose were 222 and 7.4 μmol min–1 mg–1, respectively. The relative activities of 100% for mannose-6-phosphate and D-talose were 75 and 1.6 μmolmin–1 mg–1, respectively. The 100% relative activities for glucose-6-phosphate and L-talose were 375 and 0.6 μ mol min–1 mg–1, respectively. The black and white bars represent relative activities for phosphate sugar and monosaccharide, respectively
표 Biosynthesis of L-tagatose, D-tagatose, and L-tagatose (open symbol) from L-talose, D-talose, and L-talose, repectively, and of ribulose 5-phosphate, fructose 6-phosphate, and fructose 6-phosphate, repectively, (closed symbol) from ribose 5-phosphate, maanose 6-phosphate, and glucose 6-phosphate, repectively, by R132D mutant CTRPI, R142N mutant TTMPI, T85Q PFGPI (square), respectively, comparing with the wild-type enzyme (circle).
표 Active site structures of CTRPI, TTMPI, and PFGPI with L-talose, D-talose, and L-talose, respectively.
표 Relative activities of the wild-type and mutant enzymes of CTRPI, TTMPI, and PFGPI for monosaccharides.
표 Tagatose production from galactose by various bacterial L-arabinose isomerases
표 Time course of L-arabinose isomerase catalyzed production of D-tagatose from 300 g/L D-galactose with and without boric acid. The reactions were allowed to proceed at pH 8.5 and 60 °C in 50 mM Tris-HCl buffer and in 0.40 molar ratio of boric acid to D-galactose for 20 h with 10.8 U/mL enzyme. (0) D-Galactose; (9) D-galactose + boric acid; (O) D-tagatose; (b) D-tagatose + boric acid. Data shown represent the means of three separate experiments.
표 Effect of enzyme activity on D-mannose production by P. stuartii D-lyxose isomerase.
표 Time course of D-allose production (●) from psicose (○) by C. thermocellum D-ribose-5-phosphate isomerase

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