초록 ▼

III. 연구개발 내용 및 범위
1. 연구개발 수행내용
가. 키틴 분해효소 확보 및 대량 생산 기술 개발
- 서로 다른 62종의 Bt균주로부터 degenerate primer를 사용하여 총 119종의 키틴분해효소클로닝 및 염기서열 비교 분석
- 키틴분해효소 대량발현을 위해 Bt cry 프로모터를 이용한 맞춤형 바실러스 발현시스템 개발
- 개발된 발현시스템을 이용하여 Bacillus subtilis에서 키틴분해효소 대량발현
- 곰팡이 유래 3종의 chitinase클로닝 및 염기서열 분석
- 3종의

III. 연구개발 내용 및 범위
1. 연구개발 수행내용
가. 키틴 분해효소 확보 및 대량 생산 기술 개발
- 서로 다른 62종의 Bt균주로부터 degenerate primer를 사용하여 총 119종의 키틴분해효소클로닝 및 염기서열 비교 분석
- 키틴분해효소 대량발현을 위해 Bt cry 프로모터를 이용한 맞춤형 바실러스 발현시스템 개발
- 개발된 발현시스템을 이용하여 Bacillus subtilis에서 키틴분해효소 대량발현
- 곰팡이 유래 3종의 chitinase클로닝 및 염기서열 분석
- 3종의 곰팡이 유래 chitinase과발현을 위한 발현벡터 제작 및 Aspergillus niger를 숙주균으로 대량 발현
나. 분자진화기술을 이용한 키틴 분해효소 개량
- 확보된 키틴분해효소 유전자 중 우수한 효소활성을 보이는 유전자들을 선정하여 이들을 대상으로 family shuffling 수행
- 키틴분해 활성이 증가된 변이체 확보
다. 키틴분해효소 활성 검정
- 확보된 키틴분해효소 및 개량효소의 Rhizoctoniasolani및 Pythium ultimum에 대한 항진균 활성 확인
- 확보된 키틴분해효소와 glucanase의 synergistic antifungal activity 확인
라. 신규 생물농약 개발
- 병해충의 공격에 대항하여 식물에서 생산되는 pathogenesis-related(PR)protein 중 PR3, PR4및 PR8 chitinase 유전자를 합성생물학을 이용하여 생합성
- 바실러스 발현시스템을 이용하여 PR3, PR4및 PR8 chitinase 대량발현
- PR3 chitinase의 온실가루이에 대한 살충활성 검정
- 광범위한 곤충에 대해 우수한 살충활성을 가지며 고등생물에 대한 독성이 없어 친환경적이지만 대량생산이 어려운 Gal1기반 신규 생물농약 개발을 위해 합성생물학을 이용한 gal1 유전자 생합성
-바실러스 발현시스템을 이용한 Gal1 대량발현 및 살충활성 검정
-우수한 살충활성을 가진 식물성 lec 유전자 생합성
-바실러스 발현시스템을 이용한 lec 대량발현
마. 실용화 연구
- Paenibacillus polymyxa PoxB는 대장균에서 과발현되었을 경우 효소 활성을 가지는 inclusionbody를 만들며 C-terminal에 다른 단백질을 fusion하여도 active inclusion body를 만드는 능력이 있음
- P. polymyxa PoxB를 fusion 파트너로 이용하여 Gal1과 Bt chitinase의 active inclusion body형성
- 바실러스 포자를 PM을 타겟으로 하는 효소 및 단백질의 운반 도구로 사용하기 위하여 바실러tm 포자 표면에 효소 및 단백질을 display함
- Gal1의 B.subtilis포자 표면 display
- PGPR 또는 ISR 효과가 있는 바실러스 균에 키틴분해효소를 과발현하여 성능을 향상시킴
- 보유중인 서로 다른 85종의 Bacillus균이 내는 휘발성물질의 식물생장 및 ISR 효과 조사
- 이 중 우수한 식물생장 촉진 효과 및 ISR 효과를 보이는 균을 대상으로 Btchitinase를 도입하여 과발현 및 항진균 활성 조사
2. 연구범위 및 방법
가. 키틴 분해효소 확보 및 대량 생산 기술 개발
- CAZy와 NCBI로부터 Bt키틴분해효소 정보를 수집하고 MEGA4및 Phylip프로그램을 사용하여 염기서열을 비교 분석한 후 그로부터 degenerate primer제작
- 제작된 primer를 이용하여 본 연구팀에서 확보하고 있는 Bt균주 중 서로 다른 62종의 Bt 균주 choromosome을 대상으로 PCR을 수행하여 endo-type키틴 분해 효소 확보
- endo-type chitinase의 대량발현을 위해 Bt cry프로모터를 이용한 맞춤형 발현시스템 개
발
- 개발된 발현시스템을 이용하여 B. subtilis에서 Bt chitinase과발현
- Trichoderma harzianum으로부터 RNA를 분리하여 cDNA를 제작하고 그로부터 PCR을 이용하여 Chitinase유전자 확보
- A. niger용 integration 벡터에 gpdA 프로모터, chitinase 유전자 및 pdcA terminator를 클로닝하여 발현벡터 제작
- 발효조에서 배양하여 발현양 조사
나. 분자진화기술을 이용한 키틴 분해효소 개량
- 확보된 키틴분해효소 유전자 중 우수한 효소활성을 보이는 유전자 선정
- 이들 유전자를 혼합하여 DNaseI을 이용한 DNA shuffling방법으로 분자진화 수행
- 바실러스에서 라이브러리 작업을 수행하기 위하여 형질전환 효율이 획기적으로 증대된 Bacillus균주 제작
- Chitinase 활성검정을 통한 우수활성 변이체 선발
다. 키틴분해효소 활성 검정
- 키틴분해효소 및 개량효소의 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 등 식물병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성 검정
- 확보된 키틴분해효소와 glucanase를 조합하여 synergistic antifungal activity 확인을 위한 항진균 활성 검정
라. 신규 생물농약 개발
- gal1, lec, PR3, PR4 및 PR8 전체 유전자를 코오돈 최적화기술을 이용하여 생합성
- 합성된 유전자들을 기 개발된 바실러스 발현시스템을 이용하여 발현벡터 제작
- Bacillus 숙주균을 사용하여 Gal1, Lec, PR3, PR4 및 PR8 대량발현
- Gal1, Lec 및 PR3가 대량발현된 바실러스균을 이용하여 온실가루이 및 배추좀나방을 대상으로 살충활성 검정
마. 실용화 연구
- P. polymyxa poxB 유전자의 C-ternimal region에 gal1 및 Bt chitinase 유전자 fusion
- Fusion construct를 대장균에 도입한 후 inclusion body (IB) 형성 여부 관찰
- IB 분리 후 chitinase효소 활성 측정
- Gal1의 포자표면 display 여부를 검정하기 위하여 gal1 유전자와 gfp 유전자 fusion
- Fusion construct를 Bacillus에 도입, 과발현 시킨 후 포자를 순수분리 하고 Flow cytometer를 이용하여 표면발현 여부 검정
- 보유 중인 서로 다른 85종의 Bacillus 균의 휘발성 물질이 애기장대 (Aradopsis thaliana)의 생장과 ISR에 미치는 영향을 조사
- 상기 휘발성 물질의 ISR 효과 검정을 위해 식물병원균 Erwinia cartovora에 대한 병저항성 측정
- 식물생장 및 ISR 효과가 우수한 Bacillus 균주에 Btchitinase 도입 및 과발현

Abstract ▼

Control of insect pests in agriculture is mainly achieved using chemical insecticides. However, the use of these chemical pesticides has led to several problems, including environmental pollution and increase in human health effects, such as cancer and several immune system disorders. The selection

Control of insect pests in agriculture is mainly achieved using chemical insecticides. However, the use of these chemical pesticides has led to several problems, including environmental pollution and increase in human health effects, such as cancer and several immune system disorders. The selection of insect resistant populations has also caused significant and major outbreaks of secondary pests. Although microbial insecticide have been proposed as substitutes for chemicals their use is limited since most microbes show a narrow spectrum of activity that enables them to kill only certain insect species. Moreover, they have low environmental persistence and they require precise application practices. The most successful insect pathogen used for insect control is the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt).
Bt is the most widely used environmentally compatible biopesticide and produces insecticidal Cry and Cyt proteins active against different insect pests. The mode of action of the insecticidal proteins includes ingestion of the protoxin, activation by midgut proteases to produce the toxin fragment, and an interaction with receptors displayed on midgut epithelial cells, followed by forming pores that cause osmotic shock, burst of midgut cells, and insect death. The insect midgut epithelium is protected from abrasive food particles, digestive enzymes, and pathogen infection by multiple layers of peritrophic membrane (PM) consisting of high chitin and chitin-binding protein content. Solubilized Bt toxins traverse the PM and reach the midgut epithelium in several lepidopteran species. Another report demonstrated that Bt toxins can bind the PM. These studies suggest that many Bt toxins can be trapped by the PM before it reaches the epithelium. Thus, removing the PM may increase insecticidal activity of the Bt toxins, indicating that disrupting formation of the PM is a potential strategy for insect control.