초록 ▼

현재 OECD 유전독성 가이드라인 중에서 돌연변이를 검색할 수 있는 시험방법 4가지 시험방법이 있으며, 이 중 체내에서 유전자 돌연변이를 검색할 수 있는 시험방법은 형질전환 설치류를 이용한 돌연변이시험법이 있으나, 동물 구입과 시간, 경비 등의 문제로 국내에서 시행하기 어려운 상황이다. ICH S2(R1)에서는 in vitro 방법으로 양성이 나올 경우, 의약품등의 심사에서 in vivo에서의 추적시험을 요구하고 있다. 또한 전 세계적으로 동물보호 차원의 3R 운동의 확산에 따라 동일 시험에서 여러 가지 종말점을 동시에 확인할 수

현재 OECD 유전독성 가이드라인 중에서 돌연변이를 검색할 수 있는 시험방법 4가지 시험방법이 있으며, 이 중 체내에서 유전자 돌연변이를 검색할 수 있는 시험방법은 형질전환 설치류를 이용한 돌연변이시험법이 있으나, 동물 구입과 시간, 경비 등의 문제로 국내에서 시행하기 어려운 상황이다. ICH S2(R1)에서는 in vitro 방법으로 양성이 나올 경우, 의약품등의 심사에서 in vivo에서의 추적시험을 요구하고 있다. 또한 전 세계적으로 동물보호 차원의 3R 운동의 확산에 따라 동일 시험에서 여러 가지 종말점을 동시에 확인할 수 있는 시험
방법이 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 반복투여독성시험과 연계가 가능하고 체내에서 유전자 돌연변이를 검출할 수 있는 P ig-a 유전자 돌연변이시험의 확립을 통하여 국제 검증연구에 참여할 수 있는 기반 자료를 확보하고 유세포측정기술을 활용하여 혈액시료를 통한 in vivo systemic genotoxicity 시험의 가능성을 타진하고자 하였다.
Reporter 유전자로 P ig-a 유전자를 사용하여 적혈구와 망상적혈구의 돌연변이 발생을 조사하고, 또한 clastogenicity에 대한 지표인 소핵발생 증가여부를 동일시험으로 조사하였다.
시험법 확립을 위하여 전형적인 유전독성물질인 N-nitroso-N-Ethylurea(ENU)를 SD 랫드에 28일간 반복투여 한 후, 투여 4일에 유세포분석기를 이용한 in vivo 소핵시험용 혈액을 수집하였으며, 투여 0일, 15일 29일에 P ig-a 유전자 돌연변이시험용 혈액을 수집하여 각각 분석하였다. ENU에 의한 P ig-a 유전자 돌연변이율과 소핵 발생률 모두 용량의존적으로 나타났으며, 타 시험결과와도 일치하여 시험법이 확실하게 확립되었음을 확인하였다.
물질 X, Urethane, Glycidol, 1,2-Dchloro-4-nitrobenzene에 대한 Pig-a 유전자 돌연변이시험 및 in vivo 소핵시험을 수행하였다. 물질 X, Urethane 및 1,2-Dichloro-4-nitrobenzene에서는 시험물질 투여에 의한 체중증가율의 감소는 거의 없었으나, Glycidol의 중농도와 고농도에서 대조군에 비하여 체중증가율이 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 물질 X, urethane, 1,2-dichlor-4-nitrobenzene은 P ig-a 유전자 돌연변이 발생률과 소핵발생률 모두 유의적 증가가 나타나지 않았다. 하지만 glycidol은 소핵 발생률은 대조군에 비하여 유의적인 증가를 나타내지는 않았지만, 최고농도군에서 전체 혈액 내 망상적혈구 빈도와 P ig-a 유전자 돌연변이가 발생한 망상적혈구의 빈도가 대조군에 비하여 유의적인 증가를 확인하였다.
P ig-a 유전자 돌연변이시험은 사람, 영장류 및 설치류 등 다양한 생물종에서 돌연변이 확인이 가능하고 자연 발생적 돌연변이 빈도가 낮으며, 별도의 동물 사용 없이 반복투여독성시험과 연계가 가능하다는 장점이 있어, 위해성평가 측면에서 생체 노출 및 용량 관련 정보를 반영할 수 있어 유용한 시험법으로 활용 가능한 것으로 사료된다.

Abstract ▼

In the OECD genetic toxicity guideline, tests for mutation are 4 guidelines. Test of in vivo mutation is only transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assay. But this assay is difficult to enforce in domestic issues such as animal purchase, time and expense.
If in vitro test is posit

In the OECD genetic toxicity guideline, tests for mutation are 4 guidelines. Test of in vivo mutation is only transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assay. But this assay is difficult to enforce in domestic issues such as animal purchase, time and expense.
If in vitro test is positive, ICHS2(R1) demand to follow-up test using in vivo system.
Also, depending on the spread of animal protection(3R), the test is required to multiple end-point in one test. Therefore, in this study, we were established a P ig-a gene mutation assay to tie with repeat does toxicity study, to detect gene mutation at in vivo.
To established Pig-a gene mutation assay and in vivo micronucleus assay by flow cytometry, we evaluated N-nitroso-N-Ethylurea(ENU). % reticulocyte(RET) were monitored during the P ig-a and micronucleus(MN) assays as a measure of toxicity to the erythropoeitic system. RBC and RET mutant frequency were monitored at Days -1, 15 and 29. Pig-a gene mutation and micronucleus incidence were increased in a dose-dependent fashion all treated group and confirmed consistent with the results of other tests. Also, we evaluated substance X, urethane, glycidol, 1,2-dichloro-4-nitrobenzene(DCNB) by using P ig-a gene mutation assay and in vivo micronucleus assay by flow cytometry.
Substance X, urethane, DCNB were not increased compared with vehicle control. Glycidol was not increased in %MN, but RET mutation frequency significantly increased compared with vehicle control at highest concentration at 28 day.
Pig-a gene mutation assay has an advantage which can be confirmed mutation in various species such as human, primate and rodent and linked with repeated dose toxicity test without animal for genotoxicity, also spontaneous mutation frequency was low.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 1
• 표지 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 4
• 목차 ... 5
• I. 연구개발과제 연구결과 ... 6
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 7
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 10
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 26
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 28
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 29
• 제7장 참고문헌 ... 31
• 제8장 첨부서류 ... 34