초록 ▼

○ 다양한 타이로신 유사체인 비천연아미노산의 도입: 타이로신 영양요구균주를 이용하여 residue-specific한 방법으로 다양한 비천연아미노산의 도입에 성공하였음. 타이로신을 제외한 19개 필수 아미노산을 이용한 경우에는 단백질의 발현이 없으나 타이로신 대신에 유사체를 도입한 경우, 비천연아미노산 도입 GFP 발현양이 20개 천연아미노산을 이용한 경우와 유사할 정도로 발현이 잘 됨을 확인하였음. 이를 통하여 단백질내 새로운 OH, NH2, NO2, F, Cl 등의 기능기 도입이 가능함. 특히 Tyrosyl-tRNA synthet

○ 다양한 타이로신 유사체인 비천연아미노산의 도입: 타이로신 영양요구균주를 이용하여 residue-specific한 방법으로 다양한 비천연아미노산의 도입에 성공하였음. 타이로신을 제외한 19개 필수 아미노산을 이용한 경우에는 단백질의 발현이 없으나 타이로신 대신에 유사체를 도입한 경우, 비천연아미노산 도입 GFP 발현양이 20개 천연아미노산을 이용한 경우와 유사할 정도로 발현이 잘 됨을 확인하였음. 이를 통하여 단백질내 새로운 OH, NH2, NO2, F, Cl 등의 기능기 도입이 가능함. 특히 Tyrosyl-tRNA synthetase와 비천연아미노산의 binding energy를 계산해 본 결과 단백질의 발현 양과 binding energy가 좋은 상관관계가 있음을 확인함.
○ 비천연아미노산을 통한 단백질 고정화: 비천연아미노산을 이용한 단백질의 고정화에 성공함. DOPA가 글로벌 하게 도입된 GFP를 이용하여 단백질을 고정화 할 수 있는 가능성을 확인하였고, sodium periodate (NaIO4)는 DOPA를 산화 시켜 ortho-quinone 폼으로 변경시킬 수 있고 순차적으로 친핵성 반응에 의해서 공격받을 수 있음. 따라서 키토산의 아민 그룹이 친핵성 반응을 일으키면 GFP 뮤턴트는 키토산 비드에 공유결합으로 고정화 될 수 있음을 확인함. wild-type GFP는 같은 반응으로 키토산비드에 고정화 되지 않음을 확인하였고 이는 다양한 단백질에 비천연아미노산 도입기술을 이용하면 여러 단백질의 고정화에 응용 가능함
○ 다중 비천연아미노산 도입 기술의 확보: Residue-specific 도입법과 site-specific 도입법의 조합을 통하여 두 개의 비천연아미노산을 한 단백질내에 동시에 도입하는 방법을 확립함. 형광단백질 내 위치 특이적 DOPA를 도입하고 residue-specific 방법으로 HPG를 도입하는데 성공하였음. 이는 메티오닌 영양요구주를 DE3 lysogenized시킨 뒤 비천연아미노산 도입을 위한 21th tRNA/synthetase pair를 도입함으로 해서 가능하였음. 트립신으로 digestion한 뒤 질량 분석한 결과 DOPA와 HPG가 잘 도입되었음을 확인함. 이결과는 in vivo 비천연아미노산도입을 위한 두 방법 즉 residue/site-specific 도입법이 연구자 실험실에 잘 확립되어 있음을 의미함. 또한 실험실에 polyauxotrophe가 확보되어 있기 때문에 이를 이용하면 Met유사와 Pro 유사체의 비천연아미노산의 동시 도입이 가능함.
○ 비천연아미노산 도입을 통한 센서의 개발: DOPA가 글로벌 하게 도입된 GFP를 이용하여 금속 이가이온을 탐지하는데 응용할 수 있음을 확인함. DOPA가 도입된 GFP의 경우 Cu2+에 특이적으로 결합하여 형광이 없어지고 이는 가역적이고, 특이적이며, 민감도가 매우 높음을 확인하였음. 더 나아가 DOPA가 아민화합물과 공유결합을 형성할 수 있는 특징을 이용하여 단백질의 기능 및 구조에 영향을 주지 않고 amine coated 표면에 고정화하여 구리탐지 센서의 개발에 성공함.
○ click chemistry를 이용한 단백질의 conjugation: 모델인 형광단백질에 HPG를 도입하고 azide를 가지고 있는 PEG와 Cu(I)을 매개로한 cycloaddition반응을 수행한 결과 약 60% 정도의 수율로 성공적으로 conjugation 시킬 수 있었음. 또한 분자량의 차이를 이용하여 GFP-PEG conjugate를 쉽게 분리정제 할 수 있었음. PEG conjugation 결과 GFP의 열적안정성이 급격하게 증가됨을 확인함.
○ 비천연아미노산 도입을 통한 refolding 효율증대 (이는 inclusion body 문제의 해결 수단됨): 형광단백질에 residue-specific한 방법으로 프롤린 자리에 (S)-4-fluoroproline을 도입하는 기술이 확립되어있음. 4-fluoroproline이 도입된 형광단백질을 트립신으로 digestion하여 Mass분석을 한 결과 잘 비천연아미노산이 잘 도입됨을 확인하였음. 또한 (S)-4-fluoroproline이 도입한 경우 형광단백질의 refolding efficiency가 증가되었음을 확인함. 이 결과를 바탕으로 단백질 폴딩 속도가 중요한 변수인 inclusion body 문제를 해결할 수 있는 중요한 단서라고 판단함.
○ 다양한 프롤린 유사체인 비천연아미노산의 단백질내 도입: 30개 이상의 프롤린 유사체와 대장균의 프롤린 tRNA synthetase와의 생물정보학적 연구를 통해 binding energy와 비천연아미노산의 결합 orientation을 조사한 결과 그 중에서 18개의 비천연아미노산이 도입이 가능함을 알 수 있었음. 이 분석방법에서 기존에 도입가능하다고 보고된 4-hydroxyproline, 4-aminoproline, fluoroproline등은 활성이 있는 것으로 분석되고 반응성이 없다고 알려진 3,4-phenylproline, Pipecolic acid인 것은 orientation이 잘못된 것으로 나오는 것으로 보아 모델링 결과를 신뢰할 수 있었음. 따라서 다양한 프롤린유사체를 단백질내 도입하는 것이 가능할 것임.
○ 비천연아미노산 도입을 통한 효소의 안정성증대: 오메가트랜스아미나제는 최근에 아민화합물의 생산 및 그에 대한 유용성으로 각광을 받고 있음. 아민화합물의 생산에 이용되고 있는 오메가트랜스아미나제에 fluorotyrosine을 도입한 결과 효소의 안정성 과 유기용매에 대한 안정성이 급격하게 증대되었음 하지만 효소의 광학선택성, 최적 pH, 기질특이성, 생성물 저해, 기질저해 등은 거의 변하지 않았음. 최종적으로 비천연아미노산으로 계량된 오메가트랜스아미나제가 키랄 아민화합물의 생성에 더욱 효율적임을 확인하였음.

목차 Contents

• 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
• 목 차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 4
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 5
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 6
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 6
• Ⅲ. 연구성과 ... 7