초록 ▼

○ 연구결과
1.1차년도 연구결과 (2010.7.- 2011.6.)
- Ovotransferrin 의 항균,항산화,항염 등의 기초적인 기능성 실험을 실시하여 향후 실험에 적용할 유효 농도를 설정하였다.DPPH법과 β-caroteneassay를 실시하여 ovotransferrin 1mg/mL에 서 항산화 효과를 관찰할 수 있었다.다양한 병원성 식중독 균에 대해서도 40mg/mL 농도에서 항균 효과를 관찰할 수 있었으며,Helicobacterpylori균에 대해서도 항균 효과를 관찰하였다.식품에 이용 가능한 산업용 효소를 기

○ 연구결과
1.1차년도 연구결과 (2010.7.- 2011.6.)
- Ovotransferrin 의 항균,항산화,항염 등의 기초적인 기능성 실험을 실시하여 향후 실험에 적용할 유효 농도를 설정하였다.DPPH법과 β-caroteneassay를 실시하여 ovotransferrin 1mg/mL에 서 항산화 효과를 관찰할 수 있었다.다양한 병원성 식중독 균에 대해서도 40mg/mL 농도에서 항균 효과를 관찰할 수 있었으며,Helicobacterpylori균에 대해서도 항균 효과를 관찰하였다.식품에 이용 가능한 산업용 효소를 기준으로 가수분해를 실시하였다.Ovotransferrin과 ovotransferrin 가수분해물을 다양한 인체유래 암세포에 대해 MTT assay를 이용하여 세포독성을 측정한 결과, ovotransferrin의 경우 40mg/mL의 높은 농도에서 몇몇의 암세포에 대해 50%가 넘는 세포독성을 보이는 것을 관찰하였고,가수분해물의 경우 대부분의 효소 가수분해물에서 ovotransferrin보다 암세포에 대한 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
-Iron(Fe3+)이 ovotransferrin과 결합하는데 최적의 pH 조건과 NaCl의 영향을 실험한 결과,pH 7.0의 조건과 0.1% 농도의 NaCl조건이 보다 높은 수율의 ovotransferrin을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다.또한 ovotransferrin의 분리 및 침전에 요구되어지는 최적의 에탄올 농도를 찾기 위한 실험을 진행한 결과,43%의 에탄올 농도를 적정 농도로 설정하였다.
- Ovotransferrin 및 ovotransferrin 가수분해물의 면역증강 및 항암효과를 검증하기 이전에 항산화능을 측정하기 위해 SOD-likeactivity,peroxyl라디컬 소거능,ABTS 라디컬 소거능을 측정한 결과, 모든 ovotransferrin 가수분해물에서 ovotransferrin 보다 높은 항산화 활성을 보였다. Ovotransferrin과 그 가수분해물의 인체 백혈구 DNA 손상 억제 효과를 측정하기 위해 cometassay를 실시한 결과,인위적으로 산화적 스트레스를 유발한 인체 백혈구 DNA 손상을 유의하게(34.6–53.3%)감소시키는 것을 확인하였다.또한 MTT assay,LDH releaseassay,암세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과,효소를 이용하여 가수분해를 했을 시 그 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 우리나라의 계란 소비 현황을 조사한 결과,소득이 증가됨에 따라 계란 소비량이 증가하였지만, 일정 수준의 소득 수준에 올라온 이후에는 계란의 소비가 더 이상 늘지 않는 정체 상태에 다다랐다고 판단하였다.국내의 양계산업의 발전을 위해서는 계란의 수요 증대와 가격 상승이 필요하다고 판단되었고, 이를 위해 계란의 활용도를 높일 필요가 있다고 판단되어진다. 따라서 ovotransferrin과 같은 물질의 분리 정제 및 산업화 기술은 계란의 부가가치를 높이면서 기존의 계란 소비 시장이 아닌 새로운 시장을 창출하여 활용도를 높일 것으로 기대된다.이러한 시장조사 결과를 바탕으로 판단해 볼 때,ovotransferrin의 대량생산기술이 확보되고,그 기능성 및 안전성이 입증된다면 iron과 결합된 형태로서 철분제의 원료,락토페린 대체제 및 기능성 식품의 원료로서 그 활용도는 매우 높다고 판단되었다.Ovotransferrin시험법을 및 품질 평가 기준으로는 Bradford assay를 통한 단백질 정량법과 SDS-PAGE를 통한 단백질 순도 확인,또한 HPLC를 이용하여 ovotransferrin을 정량하는 방법이 적합하다고 판단되었다.
2.2차년도 연구결과 (2011.7.- 2012.6.)
- 효소를 이용하여 가수분해를 실시할 때 ovotransferrin 획득 수율을 높이기 위하여,가수분해 조건을 용매 100mL 당 ovotransferrin2g,효소 0.08g (25:1)으로 세팅하였다.효소 가수분해물의 효율적인 생산을 위하여 반응 온도,반응 시간 및 반응 pH 등을 고려하여 생산 조건을 최적화 하고자 하였다.그 결과,반응 시간과 pH에 구분 없이 고르게 세포독성이 나타나는 것을 확인하였고, 이에 기능성을 높일 수 있는 다른 방법을 모색하였다.그러한 방법으로 mercaptoethanol과 TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride)를 이용하여 ovotransferrin의 이황화 결합을 분해하는 것인데,이를 통해 생산된 ovotransferrin의 암세포 성장 억제효과를 검증한 결과,TCEP를 이용하여 제조한 물질이 4mg/mL 농도에서도 86%의 암세포 성장 억제효과를 보임으로써 본 연구팀에서 비교적 좋은 결과를 얻을 수 있었다.하지만,효소 가수분해물에 비해 제조 방법상 산업적으로 이용하기에는 문제점이 존재하기 때문에 이를 극복할 방법을 찾아야 한다.
- 본 연구팀의 ovotransferrin의 분리 및 정제 방법은 계란의 ovotransferrin에 철 이온을 부착시켜 화학적 안정성을 높인 후 ethanol을 이용하여 ovotransferrin을 분리하는 방법이다.따라서 철 이온을 효율적으로 제거하기 위한 방법을 찾고자 하였다.먼저 pH의 영향을 조사하였는데,pH 5이하일 경우 모두 철 이온 release가 잘 일어나는 것을 확인하였고,pH를 조정하기 위해 HCl을 사용하기 보단 citricacid를 사용하는 것이 더 효과적인 것으로 확인되었다.Released된 철 이온을 제거하기 위해선 AG1-X2 resin을 사용하였는데, 그 최적 이용량을 확인한 결과, 6 mg/mL의 ovotransferrin을 함유하는 100mL solution당 0.6g의 resin을 사용하는 것이 적합하다는 결과를 얻었고,또한 한 번 제거한 것보다 두 번 제거하였을 때의 residual철 이온의 양이 훨씬 줄어드는 것을 확인하였다.
- 동물실험을 통해 ovotransferrin 및 ovotrasnferrin 가수분해물의 면역증강 및 항암효과를 검증하였다.그 결과,DMH로 유도한 대장암 rat모델에서 대장암의 전암병변인 AC (aberrantcrypt)및 ACF (aberrantcryptfoci)의 수에 ovotransferrin및 그 가수분해물이 영향을 미치는 것을 확인하였다.특히 trypsin 가수분해물을 공급한 실험군에 경우 전암병변이 확연하게 억제된 것을 확인할 수 있었다.
- Lab scale의 각 생산 단계를 검토한 결과를 바탕으로 대량 생산 공정을 확립하였고,이에 따라 난백 50 L를 가지고 scale-up test를 실시하였다.이론 상의 계란 난백 50 L 내에 존재하는 ovotransferrin의 양은 700g으로 추정된다.최종 ovotransferrin을 회수한 결과 450g으로 회수율은 64.3%였고,ovotransferrin가수분해물을 생산한다고 했을 때,회수율을 계산한 결과 421g으로 60.1%의 회수율을 확인하였다.대량 생산 공정 중 원심분리 단계에서의 손실이 가장 큰 것이 확인되어 공정의 개선이 필요할 것으로 판단되었다.Scale-uptest결과를 바탕으로 kg당 제조 원가를 계산하였을 때,kg당 ovotransferrin및 그 가수분해물의 제조 원가는 약 90만원 선으로 추정되었다. 1차년도에 조사한 바에 의하면 국내에 철분 보충제 원료로 수입되고 있는 철 이온 acetyl-transferrin (ovotransferrin)의 가격은 분말 형태가 kg 당 250만원으로,이의 대체제로 Fe-ovotransferrin을 개발할 경우 시장 경쟁력을 어느 정도 확보할 수 있을 것으로 보인다.
3.3차년도 연구결과 (2012.7.- 2013.6.)
-2차년도 동물실험 결과를 바탕으로 ovotransferrin과 trypsin효소 가수분해물을 제제화하였고,이들에 대한 미생물학적 안전성 및 기능성을 재확인하였다.제제화된 ovotransferrin및 그 가수분해물의 일반 세균수는 g 당 5.7× 10⁵ CFU,1.3× 10⁶ CFU로 측정되었으며,병원성 식중독균에 대한 검사에서는 모두 검출이 되지 않아 미생물학적 안전성을 확보하였다.제제화된 ovotransferrin 및 그 가수분해물의 암세포 성장 억제 효과를 측정한 결과,제제화된 시료에서 더 높은 암세포 성장 억제 효과를 관찰할 수 있었다.
- 본 연구팀에서는 에탄올 침전을 이용한 ovotransferrin 추출 방법 이외에 ammonium sulfate와 citricacid를 이용한 추출법도 개발하였다.이를 에탄올 추출법과 비교한 결과,에탄올 추출법은 빠른 시간 안에 ovotransferrin을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있지만,철 이온을 제거시키는 과정과 ovotransferrin외 다른 단백질을 회수할 수 없다는 단점이 있고,새로운 방법은 에탄올 추출법보다는 시간이 오래 걸리지만 다른 난 단백질을 변성 없이 같이 분리 할 수 있다는 장점이 있다.
따라서,산업적인 목적에 따라 두 방법을 선택하여 사용하여도 괜찮다고 판단하였고,또한 급격한 부피 증가로 인해 변화되는 철분의 포화 조건과 혼합 및 원심분리의 조건을 확립하였다.
- 동물실험을 통해 제제화된 ovotransferrin 및 ovotrasnferrin 가수분해물의 면역증강 및 항암효과를 검증하였다.그 결과,DMH로 유도한 대장암 rat모델에서 대장암의 전암병변인 AC (aberrant crypt)및 ACF (aberrantcryptfoci)의 수에 제제화된 ovotransferrin 및 그 가수분해물이 영향을 미치는 것을 확인하였다.
- Ovotransferrin 및 ovotransferrin의 가수분해물을 별도의 부형제 없이 동결건조 시,동결건조 된입자는 그 무게가 가볍고 얇은 비늘과 같은 성상으로 생산 공정 및 이후 원료로 사용함에 있어 취급이 불편한 단점이 있어 성상의 개선 및 안정성 개선을 위한 부형제를 평가하였다.평가를 진행한 동결보호부형제 중 trehalose의 회수율이 가장 높아 동물실험에 사용할 시료를 제조 할 때 trehalose를 첨가하여 제조하였다.동결보호부형제 별 안정성 평가에서도 trehalose를 첨가하여 제 조한 시료의 안정성이 가장 높았으며,25℃에서 보관하여도 성상이나 색의 변화가 관찰되지 않아 ovotransferrin 및 그 가수분해물의 유통조건을 실온 유통으로 설정하여도 문제가 없을 것이라 판단하였다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results of Research and Development
A. Results of Research (1st year)
The antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of ovotransferrin and its hydrolysates were investigated in vitro. Ovotransferrin has weak antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities. After hydrolysis usin

Ⅳ. Results of Research and Development
A. Results of Research (1st year)
The antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of ovotransferrin and its hydrolysates were investigated in vitro. Ovotransferrin has weak antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities. After hydrolysis using enzymes, the antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities had been increased. For developing an optimized extraction method, various pH and NaCl concentrations were tested. For developing an ovotransferrin quality assessment system, Bradford assay, SDS-PAGE method and HPLC were used.
B. Results of Research (2nd year)
For increasing the functionality of hydrolysates, mercaptoethanol and TCEP were used to breakdown disulfide bonds of ovotransferrin. Using these materials, some peptides with stronger cytotoxic activities could be produced. However, there was some process problems to use them in food systems. We have to solve these problems.
Through the animal experiments, we verified that ovotransferrin and its hydrolysates had immunostimulating/anticancer activity. In the colon cancer study, the number of AC (aberrant crypt) and ACF (aberrant crypt foci) induced by DMH in rats decreased by ovotransferrin and its hydrolysates.
50 L batches of egg white were tested for the scale-up production of ovotransferrin, and the purity and production yield was similar to the laboratory scale method. We obtained 450 g of ovotransferrin and 410 g of ovotransferrin hydrolysates. It's recovery rate were 64.3% and 60.1%, respectively. In the mass production system, we have used only single extraction. If two extraction method is used, the yield can go up to 85%. The economics of single or double extraction for ovotransferrin should be evaluated in the future.
C. Results of Research (3rd year)
Ovotransferrin and its hydrolysates with added trehalose were checked for their total plate count and reconfirmed their immunostimulating/anticancer activity. The number of total plate count for ovotransferrin and its hydrolysates were 5.7×10⁵ CFU/g and 1.3×10⁶ CFU/g, respectively. MTT assay and the cytotoxic activity of ovotransferrin and its hydrolysates indicated that the activities of ovotransferrin against cancer cell lines were maintained after hydrolysis.
Through the animal experiments, it was verified that ovotransferrin and its hydrolysates with added trehalose have immunostimulating/anticancer activity. In the colon cancer study using a rat model, the number of AC (aberrant crypt) and ACF (aberrant crypt foci) induced by DMH were decreased by ovotransferrin and its hydrolysates.
To improve appearance and increase stability of ovotransferrin, freeze protectors were tested. Trehalose was the best freeze protector. Trehalose protected ovotransferrin and maintained its color and appearance during the storage at 25℃.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 11
• CONTENTS ... 14
• 목 차 ... 15
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 17
• 제 1 절 연구개발의 목적 ... 17
• 제 2 절 연구개발의 중요성 ... 18
• 제 3 절 연구개발의 내용 및 범위 ... 20
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 1. 본 연구관련 국내외 기술수준 비교 ... 23
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 26
• 제 1 절 1차년도 연구개발수행 내용 및 결과 ... 26
• 1. 면역증강 및 항암효과를 가지는 ovotransferrin 가수분해물의 효율적인 생산 조건 확립 ... 26
• 2. 계란 흰자로부터 ovotransferrin 추출방법 개발 ... 37
• 3. In vitro 실험을 통한 ovotransferrin 및 ovotransferrin 가수분해물의 면역증강 및 항암효과 검증에 대한 그 기전 구명 연구 ... 44
• 4. Ovotransferrin의 시장 조사 및 품질평가 기준 확립 ... 53
• 제 2 절 2차년도 연구개발수행 내용 및 결과 ... 66
• 1. Ovotransferrin 가수분해물의 생산 최적화 ... 66
• 2. 기능성 향상을 위한 ovotransferrin 활성화 방법 개발 ... 73
• 3. 동물실험을 통한 ovotransferrin 및 ovotransferrin 가수분해물의 면역증강 및 항암효과 검증 및 그 기전 구명 연구 ... 79
• 4. Ovotransferrin 가수분해물의 대량생산공정 개발 ... 83
• 제 3 절 3차년도 연구개발수행 내용 및 결과 ... 95
• 1. 제제화된 ovotransferrin 및 ovotransferrin 가수분해물의 미생물학적 안전성 확보 및 기능성 재확인 ... 95
• 2. Ovotransferrin의 경제적인 semi-large 규모의 시스템 확립 ... 102
• 3. 제제화된 ovotransferrin 및 ovotransferrin 가수분해물 제형의 면역증강 및 항암효과 검증 및 그 기전 구명 연구 ... 113
• 4. Ovotransferrin 및 ovotransferrin 가수분해물의 식품제제화 ... 121
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 127
• 제 1 절 연구개발목표의 달성도 ... 127
• 제 2 절 관련분야의 기술발전에의 기여도 ... 134
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 136
• 제 1 절 논문 실적 ... 136
• 제 2 절 학술대회 발표 실적 ... 136
• 제 3 절 특허 실적 ... 137
• 제 4 절 기술이전 실적 ... 138
• 제 5 절 인력활용 및 양성효과 ... 139
• 제 6 절 연구결과 기대효과 ... 139
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 141
• 제 1 절 과제 관련 해외 학술 논문 정보 ... 141
• 제 7 장 참고문헌 ... 143
• 연구개발보고서 초록 ... 147
• 끝페이지 ... 152