보고서 정보
주관연구기관 |
한국국제대학교 산학협력단 |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2013-08 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201400000145 |
과제고유번호 |
1545003908 |
사업명 |
생명산업기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-05-07
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201400000145 |
초록
▼
○ 연구결과
■ AMPK를 타겟으로 한 지방합성 효소 전사 조절 네트워크 규명
-Fat-overloading 유도 모델 및 NASH 세포모델 확립을위해High glucose로 유도된 간세포주를 확립하여 활용하였다.
-인체 간세포 HepG2 세포에서 개똥쑥 및 복령 열수추출물의 세포독성을 MTT 및 LDH assay 통해 측정한 결과 500μg/ml의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았다.
-지방합성 효소발현 전사조절인자인 SREBP-1 promoter를 활용하여 비알콜성 지방간염 억제 in vitro 스크리닝법
○ 연구결과
■ AMPK를 타겟으로 한 지방합성 효소 전사 조절 네트워크 규명
-Fat-overloading 유도 모델 및 NASH 세포모델 확립을위해High glucose로 유도된 간세포주를 확립하여 활용하였다.
-인체 간세포 HepG2 세포에서 개똥쑥 및 복령 열수추출물의 세포독성을 MTT 및 LDH assay 통해 측정한 결과 500μg/ml의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았다.
-지방합성 효소발현 전사조절인자인 SREBP-1 promoter를 활용하여 비알콜성 지방간염 억제 in vitro 스크리닝법을 확립하였으며, 위의 system을 활용하여 비알콜성 지방간염 억제효과를 나타내는 개똥쑥 및 복령등 천연물 소재2건을 확보하였다.
- 확립된 in vitro 비알콜성 지방간 세포주에서 배양 조건에서 개똥쑥 추출물 (Artemisia annua extract; AAE)과 복령 추출물 (Poria cocos extract PCE)의 지질축적 억제 효능을 평가한 결과 고농도 (200μg/ml)에서 30mM 고농도의 glucose처리에 의해서 증가한 지질의 축적이 개똥쑥 추출물과 복령 추출물 처리에 의해서 억제되었음을 확인하였다.- 또한, 고농도의 glucose처리에 의해서 증가한 triglycerides 및 total cholesterol 함량도 개똥쑥 추출물과 복령 추출물 처리에 의해서 감소하였다.
- 개똥쑥 추출물과 복령 추출물에 의해서 high glucose 처리에 의해서 증가한 FAS 및 SREBP-1c 단백질 발현이 감소함을 확인하였다.- 개똥쑥 추출물과 복령 추출물의 FAS 및 SREBP-1c 활성억제 관여하는 상위 신호전달체계를 조사한 결과, 개똥쑥 추출물과 복령 추출물에 의해서 지방합성효소의 활성을 억제하는 AMPK 및 ACC의 인산화가 증가하였다.
-개똥쑥 추출물과 복령 추출물에 의해 감소한 FAS 와 SREBP-1단백질 발현이 AMPK 저해제에 의해서 감소하지 않았으며, 개똥쑥 추출물과 복령 추출물에 의해 감소한 지질축적이 AMPK 저해제에 의해서 감소하지 않음을 확인하였다.- 위의 결과에서 개똥쑥 추출물의 FAS 및 SREBP-1c의 발현 억제는 AMPK 인산화 pathway를 통해 이루어짐을 알 수 있었다.
-AMPK의 상위 신호 체계를 규명한 결과, 개똥쑥 및 복령 추출물에 의해서 LKB1(Ser428)의 인산화와 CaMKIIα (Thr286)의 인산화가 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.
■ 비알콜성 지방간염 동물모델을 이용한 간 지방합성 효소 및 분자기전 연구
- In vivo에서 개똥쑥 및 복령 추출물의 비알콜성 지방간 개선 효능을 평가하기 위하여 고지방식이 (High Fat Diet : HFD) 동물 모델을 확립하였다.
- 개똥쑥 및 복령 추출물에 의해서 지방합성효소인 FAS 및 상위 전사조절인자인 SREBP-1c의 단백질 발현이 감소하였다. 또한, 고지방 식이에 의해서 감소한 AMPK의 인산화가 개똥쑥 및 복령 추출물을 투여한 그룹에서는 다시 증가함을 확인하였다.
- 고지방 식이에 의해 증가된 마우스의 체중 및 간조직의 무게가 개똥쑥 및 복령 추출물 투여에 의해서 감소하였으며, 내장지방 (복부지방)의 무게도 감소함을 확인하였다. 또한 고지방식이에 의해서 증가한 혈청 내 glucose(혈당)이 개똥쑥 및 복령 추출물 투여에 의해서 감소함을 확인하였다.
- 고지방 식이에 의해 증가된 triglyceride 및 total cholesterol의 함량이 개똥쑥 및 복령 추출물 투여에 의해서 감소하였다. 또한 분자생물학적 조직염색법 (hematoxylin and eosin 염색법) 실험을 통해 조직내의 지방의 축적 정도 및 steatosis 정도를 측정한 결과 지방의 축적이 개똥쑥 및 복령 추출물에 의해서 감소함을 확인하였다.
- in vivo에서 고지방식이에 의한 개똥쑥 및 복령 추물물의 간 손상 보호효과를 조사한 결과, 고지방식 이에 의해서 증가한 AST, ALT 효소의 활성이 개똥쑥 및 복령 추출물 투여에 의해서 감소함을 확인하였다.
Abstract
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Ⅳ. The research results and the recommendation
1. The protective effect of AAE and PCE on high glucose-induced hepatic
lipid accumulation, and elucidate the molecular mechanisms behind its
effects in vitro hepatocytes
○ To characterize the effect of medicinal herb plants to AMPK signalin
Ⅳ. The research results and the recommendation
1. The protective effect of AAE and PCE on high glucose-induced hepatic
lipid accumulation, and elucidate the molecular mechanisms behind its
effects in vitro hepatocytes
○ To characterize the effect of medicinal herb plants to AMPK signaling, lipid metabolism
and high glucose-induced lipid accumulation in the HepG2 hepatocyte model was studied.
HepG2 cells were incubated in serum-free DMEM containing normal (5.5 mM D-glucose) or high concentrations of glucose (30 mM D-glucose), and subsequently treated with medicinal herb extracts.
○ We first determined the concentration dependence of the cytotoxic effects of AAE or PCE (0, 50, 100, 250, and 500 mg/ml) in the absence or presence of high glucose (30 mM) for 48 h in HepG2 cells using MTT and LDH assays. AAE or PCE athigh concentrations displayed no cytotoxic effects on the cells.
○ To observe the effects of AAE or PCE on lipid accumulation, HepG2 cells were treated with various concentrations of AAE or PCE (0, 10, 100, and 200mg/ml) for 24h and stained with Nile Red. As the results, AAE or PCE dose-dependently reduced intracellular lipid accumulation without cytotoxicity.
○ AAE or PCE significantly decreased thetriglyceride and total cholesterol accumulation in a dose-dependent manner.
○ Western blot analysis revealed that the lipogenic protein levels of FAS and SREBP-1 were reduced in AAE or PCE-treated HepG2 cells.
○ To determine whether the hypolipidemic effects of AAE or PCE are mediated by AMPK, we examined AMPK phosphorylation, which indicates AMPK activation. AAE or PCE supplementation dose-dependently increased AMPK activity and ACC phosphorylation.
○ To confirm the role of AMPK in the regulation of metabolic gene expression, HepG2 hepatocytes were preincubated for 1 h with the selective AMPK inhibitor compound C. Compound C pretreatment attenuated the inhibitory effects of AAE or PCE on SREBP-1 and FAS expression. Moreover, although AAE or PCE significantly decreased the lipid content in cells exposed to high glucose concentrations, compound C abolished this inhibitory effect of AAE or PCE.
2.The potential health benefits of AAE an PCE on NAFLD and related disorders in high-fat diet (HFD)-inducedobese mice
○ To investigate the activity of AAE or PCE in the liver, we used obese mice after 4 weeks of HFD feeding. Mice were divided into three groups. The ICR mice were divided into four groups (each group, n = 5) and fed with ND or HFD supplemented with AAE or HFD supplemented with PCE (200 mg/kg/day). After 4 weeks of dietary manipulation to induce obesity, 15 animals in the HFD group were divided into three experimental groups (each group, n = 5) : Group 1 received a HFD ; Group2received the HFD with AAE (200 mg/kg/day) ; Group 3 received the HFD with PCE (200 mg/kg/day).
○ AAE or PCE reduced the body weight, liver weight, serum AST, serum ALT, and serum glucose in obese mice.
○ The gross appearance and H&E analysis of the liver revealed fatty infiltration in the HFD control group compared to mice fed the ND ; however, fatty infiltration was not observed in the livers of AAE or PCE-treated mice.As shown in results, AAE or PCE treatment decreased HFD-induced hepatic triglyceride and total cholesterol levels.
○ To determine the molecular mechanism by which AAE or PCE exerts its hypolipidemic effects, Western blot analysis was performed to examine the expression of proteins involved in lipid metabolism. As shown in results, AAE or PCE decreased the level of mature SREBP-1in the liver. Furthermore, the expression of the SREBP-1 target gene FAS was reduced by AAE or PCE.
○ These results suggest that AAE or PCE regulates hepatic lipid metabolism through regulating the expression of proteins related to lipid metabolism, eventually leading to the suppression of lipogenesis.
○ In conclusion, this study demonstrated that AAE and PCE supplementation results in markedly lower lipid accumulation, AMPK phosphorylation up-regulation and lipogenic gene such as FAS and SREBP-1c down-regulation in the livers of mice and HepG2 cells. This suggests that AAE and PCE can have protective effects against HFD-induced hepatic steatosis via enhanced hepatic lipid metabolism via AMPK activation, thus providing a therapeutic approach to prevent non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- SUMMARY ... 9
- CONTENTS ... 13
- 목 차 ... 14
- 제 1장 연구개발과제의 개요 ... 15
- 제 1절 연구개발대상 기술의 경제적․산업적 중요성 및 연구개발의 필요성 ... 15
- 제 2장 국내외 기술개발 현황 ... 20
- 제 1절.국내 연구 현황 ... 20
- 제 2절.국외 연구 현황 ... 21
- 제 3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 26
- 제 1절:개똥쑥,복령 추출물의 비알콜성 지방간 억제효과 연구 ... 26
- 1.서 론 ... 26
- 2.재료 및 방법 ... 30
- 3.결과 및 고찰 ... 33
- 가.High glucose로 유도된 간세포주에서 개똥쑥 및 복령 추출물의 비알콜성 지방간억제효과 및 작용기전 규명 ... 33
- 나.고지방식이 동물모델에서 개똥쑥 및 복령 추출물의 비알콜성 지방간억제효과 및 작용기전 규명 ... 47
- 4.요약 ... 58
- 제 4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 62
- 제 5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 63
- 제 6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 65
- 제 7 장 연구시설‧장비 현황 ... 67
- 제 8 장 참고문헌 ... 67
- 끝페이지 ... 76
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