초록 ▼

○ 연구결과
각 세부 과제별 연구 내용이 유기적으로 수행되어 백신 제조에 필요한 균주 확보에서 효능평가까지 성공적인 결과를 도출할 수 있었다. 과제 1차년도에 1차 목표였던 돼지 써코바이러스 2형 단일 백신을 제조하여 품목 허가를 받고, 야외 임상 실험까지 수행하였다. 먼저 국내에서 분리된 돼지 써코바이러스 2형 바이러스를 백신주로 선정하여 특성을 분석하고 증식 능력을 최적화하였으며, 아울러 향후 바이러스 역가를 높일 수 있는 세포주의 개발을 수행하였다. 선정된 백신주와 부형제의 다양한 조성을 통해 최대 효과를 낼 수 있는 조

○ 연구결과
각 세부 과제별 연구 내용이 유기적으로 수행되어 백신 제조에 필요한 균주 확보에서 효능평가까지 성공적인 결과를 도출할 수 있었다. 과제 1차년도에 1차 목표였던 돼지 써코바이러스 2형 단일 백신을 제조하여 품목 허가를 받고, 야외 임상 실험까지 수행하였다. 먼저 국내에서 분리된 돼지 써코바이러스 2형 바이러스를 백신주로 선정하여 특성을 분석하고 증식 능력을 최적화하였으며, 아울러 향후 바이러스 역가를 높일 수 있는 세포주의 개발을 수행하였다. 선정된 백신주와 부형제의 다양한 조성을 통해 최대 효과를 낼 수 있는 조성 비율로 시작품을 제조하여 기본 성상 시험 및 실험 동물에서의 안전성, 면역원성 시험에서 국가 검정 기준에 적합함을 확인하였고 백신의 대량 생산 공정을 마련하였다. 또한 목적 동물인 돼지에 접종 실험을 실시하여 바이러스 공격 접종에 대한 예방 효과를 확인하였고 실제 농장 실험에 적용하여 생산성 향상에도 효과를 나타냈다. 향후 써코-마이코 혼합백신 제조를 위하여 마이코플라즈마 균에 대한 분리 및 진단 프로토콜을 확립하여 백신 균주로 사용할 후보 균주를 선별하였다. 과제 2차년도에는 개발된 돼지 써코바이러스 2형 백신을 사용하여 다양한 효능평가를 실시하였다. 웅돈에서의 정액 내 바이러스 배출 감소 효과를 확인하였고, 수입백신과의 비교 효능 평가에서 대등한 효과를 나타냄으로써 보편적으로 상용화된 수입백신을 대체할수 있는 가능성을 보았다. 특히 2차년도에는 백신의 단순한 항체 형성 능력 이외에 최근 중요한 면역 지표로 사용되고 있는 세포 매개성 면역 유도에 대한 연구를 수행하였다. 이를 통해 개발된 돼지 써코바이러스 2형 백신이 항체 형성 능력 뿐만 아니라, 임파구를 통한 세포매개성 면역을 충분히 유도하는 것을 확인하였다. 또한 써코-흉막 혼합백신의 시작품을 제작하여 기본 성상 시험 및 안전성 시험, 면역원성 시험 등 품목 허가 시험을 실시하여 국가 검정 기준에 부합함을 확인하였고, 혼합 백신 내의 각 항원에 대한 면역 반응 및 예비 효능 실험을 통하여 목적 동물인 돼지에서 예방 효과를 확인하였다. 아울러, 1차년도에 분리한 마이코플라즈마 균주를 토대로 써코-마이코 혼합 백신을 조성하여 목적 동물에 대한 체액성, 세포성 면역 반응을 확인하였다.
3차년도에는 써코-흉막 혼합백신의 실험실 내 공격 접종 및 야외 농장 실험을 통하여 혼합 백신이 각 바이러스 및 세균을 각각 방어할 수 있음을 확인하였고, 농장의 생산성 향상면에서도 우수한 효능을 나타냈다. 또한 2차년도에 조성된 써코-마이코 혼합 백신에 대한 실험실 내 공격 접종 실험을 실시하여, 각 단일 백신이 나타내는 효과를 혼합 백신이 충분히 유도할 수 있음을 확인하였다.

Abstract ▼

Porcine circovirus-associated disease (PCVAD), which is caused by porcine circovirus type 2 (PCV2), has been recognized as one of the most economically important diseases in the global swine industry, including in Korea. The annual economic loss
from severe PCVAD (10-15% mortality) is Approximate

Porcine circovirus-associated disease (PCVAD), which is caused by porcine circovirus type 2 (PCV2), has been recognized as one of the most economically important diseases in the global swine industry, including in Korea. The annual economic loss
from severe PCVAD (10-15% mortality) is Approximately estimated 350 bilion Won according to the Korea Rural Economic Institute. Since PCV2 vaccines were introduced into the world market in 2006, vaccination is a major tool for the control of PCV2 infection. In korea, since the first PCV2 vaccine was introduced in 2008, now five fully licensed commercial vaccines from international companies and six fully licensed commercial vaccines from Korean companies are available in Korea. The korean pharmaceutical companies started producing PCV2 vaccine in 2009, but market share was only 8.1 % in total marketing. This is because most farm choose the imported PCV2 commercial vaccines as they didn't have confidence in effect of the PCV2 vaccine produced from korean companies. The effects of imported commercial PCV2 vaccine have been demonstrated in numerous field and laboratory studies. But because of antigen purification system, imported PCV2 vaccine used the most in korea was produced in high manufacture cost so vaccine price was relatively high. Therefore, the main purpose of this research is the development of PCV2 vaccine that have highly protective effects as much as the imported PCV2 vaccine and produced in the lower cost.
Actinobacillus pleuropneumoniae induced porcine respiratory disease complex (PRDC) in pigs of 10-15 weeks age infected with PCV2 and thus each vaccination against PCV2 and A. pleuropneumoniae need to prevent PRDC. But vaccination respectively, was expense-bearing and causing labor problem. Therefore, in addition to development of single PCV2 vaccine, we developed the combined PCV2-A. pleuropneumoniae vaccine in this research. This combined vaccine can be the most competitive vaccine in korea since no other this type of vaccine was produced and resolve the problem with each of single vaccination.
This project of the Animal Vaccination Center covers the investigation of diverse vaccine effect as well as the development of the vaccine. Generally, humoral immune response against PCV2 vaccination was demonstrated in many previous studies, but
the information of cell-mediated immune response against PCV2 vaccination was relatively little. Therefore we evaluated the interferon-r secreting cell, proportion of T-cell lymphocyte, and DTH test to analysis a level of cell-mediated immune
response against developed PCV2 vaccine. In virus challenging study, the developed PCV2 vaccine significantly induced the cell-mediated immune responses as well as the production of neutralizing antibody and these effects of vaccination reduced the viremia, virus excretion, and histopathologic lesion. Concurrently, conventional farm study was performed to evaluate the improvement of economical aspect followed by the developed PCV2 vaccination. In addition, experimental vaccination study with boar was performed to identify the effects of vaccination on reducing virus excretion in semen. In this study, the shedding of virus in semen in vaccinated boar were significantly lower than non-vaccinated boars. Also, comparison studies between the developed PCV2 vaccine and the commercial imported vaccine were also performed to compare the level of protective immune responses by the vaccines. As a results, the developed PCV2 vaccine induced equal or more effects on prevention of PCV2 compared to the commercial imported vaccine and thus we expect that the developed PCV2 vaccine can substitute the commercial imported vaccine.
Generally, PK-15 cell was used to replicate PCV2 virus. but PCV2 virus can not be replicated in most PK-15 cell more than titer of 10⁴ TCID50/ml. To resolve this problem, we developed the cell line derived from swine kidney that have the ability of
replicating PCV2 more than titer of 10⁶ TCID50/ml. Therefore we can produce the PCV2 vaccine with high titer of PCV2 antigen in low cost of production.
In case of the combined PCV2 - A. pleuropneumoniae vaccine, the most important issue was a proportion of each antigen in 1 dose vaccine. Through a diverse study with different antigen proportion, the optimal composition of the combined vaccine
could be determined. The developed combined vaccine could induce the immune response against PCV2 and A. pleuropneumoniae respectively, as much as each of the single vaccination did. Also, in conventional farm study, vaccination of the developed combined vaccine improve the mortality and average weight gain as reduced the occurrence of PMWS and PRDC. As a result, this vaccine will offer new strategy of vaccination to conventional farm, satisfying the efficacy, convenience, and economic properties.
Mycoplasma hyopneumoniae is a causative pathogen of porcine epizootic pneumoniae. M. hyopneumoniae induced the PRDC concurrently infected with PCV like A. pleuropneumoniae. M. hyopneumoniae also may cause the PMWS to potentiate the
PCV2 replication. In first year of the research like PCV2-A. pleuropneumoniae combined vaccine, PCV2-M. hyopneumoniae combined vaccine was developed and used in various experimental studies to demonstrate effects of the vaccination. In case of M. hyopneumoniae, unlike other bacteria it is difficult to diagnosis, isolation and culture. Therefore in first year of the project, we mainly tried to develop the methods associated to rapid diagnosis, isolation from samples, and culture. In previous
studies, it was demonstrated that humoral immune responses were not critical to prevent against M. hyopneumoniae, and thus cell-mediated immune response by the developed combined vaccine was mainly evaluated in a diverse experimental studies such as ELISPOT, flow cytometry, and DTH test. The PCV2 single and PCV2-A.
pleuropneumoniae, PCV2-M. hyopneumoniae combined vaccines developed from this project were relatively low cost of production and the efficacy in prevention of disease were demonstrated by various clinical and field studies. Therefore, these
vaccines were expected to be competitive in marketing of vaccine and contribute to increase of productivity in pig industry.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 14
• CONTENTS ... 17
• 목 차 ... 22
• 제 1 장 서 론 ... 26
• 제 1 절 연구개발의 목적과 범위 ... 26
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 28
• 제 1 절 국내 제품생산 및 시장 현황 ... 28
• 제 2 절 국외 제품생산 및 시장 현황 ... 28
• 제 3 절 연구결과가 국내외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 29
• 제 3 장 돼지 써코바이러스 단일백신과 흉막폐렴 제조 기술이전 표준화 연구 및 품목허가 시험 ... 31
• 제 1 절 서 설 ... 31
• 제 2 절 재료 및 방법 ... 32
• 1. 돼지 써코바이러스 단일백신 시제품 부표 확립 ... 32
• 2. PK-15 세포 배양 표준화 연구 ... 34
• 3. 돼지 써코바이러스 증식 표준화 연구 ... 35
• 4. 돼지 써코바이러스 단일백신의 시제품 제작 ... 36
• 5. 돼지 써코바이러스 단일백신 제품 품목허가를 위한 예비 실험 ... 37
• 6. 국가검정 동물용의약품검정기준에 의한 돼지 써코바이러스 단일백신 안전성 검사 실시 ... 38
• 7. 돼지 써코바이러스 단일백신 공격실험 실시 ... 39
• 8. 돼지 태아 신장 유래 초대 배양 세포(SK cell)를 이용한 바이러스 증식 연구 ... 42
• 9. 돼지 흉막폐렴균 배양 표준화 연구 ... 43
• 10. 돼지 써코바이러스와 흉막폐렴 복합백신 시작품 제작 ... 44
• 11. 돼지 써코바이러스와 흉막폐렴 복합백신의 공격접종을 통한 효능 검사 ... 47
• 12. 국가검정 동물용의약품검정기준에 의한 돼지 써코흉막 복합백신 안전성 시험 ... 52
• 13. 웅돈을 이용한 돼지 써코바이러스 단일백신의 차별화된 효능 연구 ... 53
• 14. 돼지 써코바이러스 항원과 마이코플라즈마 항원의 복합 기술 개발 연구 ... 60
• 제 3 절 결과 및 고찰 ... 61
• 1. 돼지 써코바이러스 2형 증식 표준화 연구 ... 61
• 2. 돼지 써코바이러스 단일백신의 시제품 제작 ... 61
• 3. 돼지 써코바이러스 단일백신 제품 품목허가를 위한 예비 실험 ... 62
• 4. 국가검정 동물용의약품검정기준에 의한 돼지 써코바이러스 2형 단일백신 안전성 검사 실시 ... 65
• 5. 돼지 써코바이러스 2형 단일백신 공격실험 실시 ... 69
• 6. 돼지 태아 신장 유래 초대 배양 세포(SK cell)를 이용한 배양된 돼지 써코바이러스 2형 역가 측정 ... 77
• 7. 돼지 흉막폐렴균 배양 표준화 연구 ... 78
• 8. 돼지 써코바이러스와 흉막폐렴 복합백신 시작품 제작 ... 82
• 9. 돼지 써코바이러스 2형과 흉막폐렴 복합백신 면역 유도 실험 ... 84
• 10. 돼지 써코바이러스와 흉막폐렴 복합백신의 공격접종을 통한 효능 검사 ... 86
• 11. 돼지 써코바이러스 2형과 흉막폐렴 복합 시험백신 안전성 시험 및 결과 ... 101
• 12. 웅돈을 이용한 돼지 써코바이러스 단일백신의 차별화된 효능 연구 ... 105
• 13. 돼지 써코바이러스 항원과 마이코플라즈마 항원의 복합 기술 개발 연구 ... 111
• 제 4 장 돼지 써코바이러스 증식 최적화 연구 ... 113
• 제 1 절 서 설 ... 113
• 제 2 절 재료 및 방법 ... 115
• 1. 돼지 써코바이러스 증식용 세포주의 제작 ... 115
• 2. 세포주의 개발 및 돼지 써코바이러스 2형 감수성 검사 ... 117
• 3. 돼지 써코바이러스 생산을 위한 최적의 배양조건 탐색 ... 118
• 제 3 절 결과 및 고찰 ... 120
• 1. 돼지 써코바이러스 2형 증식용 세포주의 제작 ... 120
• 2. 세포주의 개발 및 돼지 써코바이러스 2형 감수성 검사 ... 121
• 3. 돼지 써코바이러스 2형 생산을 위한 최적의 배양조건 탐색 ... 123
• 제 5 장 백신 품목 허가를 위한 야외임상 실험 ... 127
• 제 1 절 서 설 ... 127
• 제 2 절 재료 및 방법 ... 128
• 1. 돼지 써코바이러스 단일백신의 야외 임상 실험 ... 128
• 2. 개발된 돼지 써코바이러스 단일백신의 면역학적 반응 연구 ... 132
• 3. 개발된 돼지 써코바이러스 2형 단일백신과 수입 써코바이러스 단일백신과의 비교 효능 검사 ... 136
• 4. 개발된 돼지 써코바이러스 단일백신관 국내 써코바이러스 단일백신과의 비교 효능 검사 ... 142
• 5. 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 흉막폐렴균 복합백신 야외 임상 시험 ... 148
• 제 3 절 결과 및 고찰 ... 153
• 1. 돼지 써코바이러스 2형 단일백신의 야외 임상실험 ... 153
• 2. 개발된 돼지 써코바이러스 2형 단일백신의 면역학적 반응 연구 결과 ... 175
• 3. 개발된 돼지 써코바이러스 2형 단일백신과 수입 써코바이러스 단일백신의 비교 효능 검사 ... 181
• 4. 개발된 돼지 써코바이러스 2형 단일백신관 국내 써코바이러스 단일백신의 비교 효능 검사 ... 194
• 5. 돼지 써코바이러스 및 돼지 흉막폐렴균 복합백신 야외 임상 시험 결과 ... 205
• 제 6 장 마이코플라즈마 분리 및 배양법 연구 ... 233
• 제 1 절 서 설 ... 233
• 제 2 절 재료 및 방법 ... 234
• 1. 마이코플라즈마 분리 ... 234
• 2. 마이코플라즈마 분리법 프로토콜 ... 238
• 3. 마이코플라즈마 독성 평가 ... 243
• 제 3 절 결과와 고찰 ... 244
• 1. 마이코플라즈마 표준 균주를 이용한 분리 배양액 비교 결과 ... 244
• 2. 등온증폭반응기법(Loop Mediated Isothermal Amplification: LAMP)을 이용한 검출 결과 확인 ... 244
• 3. 마이코플라즈마 야외 분리 균주 확인 ... 246
• 4. 마이코플라즈마 독성 평가 ... 249
• 제 7 장 돼지 써코바이러스와 마이코플라즈마균 복합백신 연구 ... 253
• 제 1 절 서 설 ... 253
• 제 2 절 재료 및 방법 ... 254
• 1. 돼지 마이코플라즈마 최적 배양법 개발 ... 254
• 2. 돼지 마이코플라즈마 검출법 개발 ... 255
• 3. 돼지 마이코플라즈마 분리 배양법 개발 ... 257
• 4. 돼지 마이코플라즈마 야외 균주 분리 방법 확립 ... 258
• 5. 마이코플라즈마 Consensus PCR의 개발 ... 259
• 6. 마이코플라즈마 하이오뉴모니에와 하이오라이니스 야외 분리 균주 확보 ... 261
• 7. 돼지 마이코플라즈마 세균 접종방법 개발 ... 263
• 8. 돼지 마이코플라즈마 야외분리균주 병원성 비교방법 확립 ... 265
• 9. 마이코플라즈마 백신 제작 및 세포성 면역 유도 실험 효능 연구 ... 266
• 10. 돼지 써코바이러스와 마이코플라즈마 복합백신의 공격접종을 통한 효능 검사 ... 269
• 제 3 절 결과와 고찰 ... 273
• 1. 돼지 마이코플라즈마 최적 배양법 개발 ... 273
• 2. 돼지 마이코플라즈마 검출법 개발 ... 284
• 3. 돼지에서 마이코플라즈마 신속 분리 배양법 개발 ... 290
• 4. 돼지 마이코플라즈마 야외 균주 분리 방법 확립 결과 ... 292
• 5. 마이코플라즈마 Consensus PCR 개발 결과 ... 295
• 6. 마이코플라즈마 하이오뉴모니에와 하이오라이니스 야외 분리 균주 확보 결과 ... 301
• 7. 돼지 마이코플라즈마 세균 최적 접종방법 개발 결과 ... 305
• 8. 돼지 마이코플라즈마 야외분리균주 병원성 비교방법 확립 결과 ... 310
• 9. 마이코플라즈마 단일백신의 효능 평가 실험 결과 ... 314
• 10. 돼지 써코바이러스와 마이코플라즈마균 복합백신의 공격접종을 통한 효능 검사 결과 ... 317
• 제 8 장 백신 제조 기술 및 대량 생산 공정 연구 ... 325
• 제 1 절 서 설 ... 325
• 제 2 절 재료 및 방법 ... 326
• 1. PK-15 세포주 및 바이러스 종독의 seed lot 확립 및 배양기술 확립 ... 326
• 2. 돼지 써코바이러스의 정제 기술 확립 ... 326
• 3. 흉막폐렴균 항원 정제기술 확립 ... 327
• 4. 돼지 써코바이러스 단일백신과 흉막폐렴 복합백신 제조 기술 확립 ... 329
• 5. 돼지 써코 바이러스 대량 생산 증식 방법 확립 ... 337
• 6. 흉막폐렴균 대량 증식방법 확립 ... 343
• 7. 복합백신 제조 공정의 표준화 ... 345
• 제 3 절 결과 및 고찰 ... 346
• 1. PK-15 세포주 및 바이러스 종독의 seed lot 확립 및 배양기술 ... 346
• 2. 돼지 써코바이러스의 정제 기술 확립 ... 346
• 3. 흉막폐렴 항원 정제기술 확립 ... 347
• 4. 돼지 써코바이러스 단일백신과 흉막폐렴 복합백신 제조 기술 확립 ... 349
• 5. 돼지 써코바이러스 대량 생산 증식 방법 확립 ... 354
• 6. 흉막폐렴균 대량 증식방법 확립 ... 358
• 제 9 장 백신 등록 허가 시험 ... 363
• 제 1 절 서 설 ... 363
• 제 2 절 재료 및 방법 ... 364
• 1. 돼지 써코바이러스 2형 단일백신 품목허가 시험 실시 (제조 직후) ... 364
• 2. 돼지 써코바이러스 단일백신품목허가 시험 실시 (안정성 확인) ... 365
• 3. 돼지 써코바이러스 단일백신 등록 허가서 제출 ... 367
• 4. 돼지 써코바이러스 및 흉막폐렴 백신 품목허가 시험 실시 (제조 직후) ... 369
• 5. 돼지 써코바이러스 및 흉막폐렴 백신 품목허가 시험 실시 (안정성) ... 374
• 6. 돼지 써코바이러스 및 흉막폐렴 백신 품목허가 제출 ... 376
• 제 3 절 결과 및 고찰 ... 377
• 1. 돼지 써코바이러스 단일백신 품목허가 시험 실시 (제조 직후) ... 377
• 2. 돼지 써코바이러스 단일백신품목허가 시험 실시 (안정성 확인) ... 380
• 4. 돼지 써코바이러스 및 흉막폐렴 복합백신 품목허가 시험 실시 (제조 직후) ... 383
• 5. 돼지 써코바이러스 및 흉막폐렴 복합백신 품목허가 시험 실시 (안정성) ... 388
• 6. 돼지 써코바이러스 및 흉막폐렴 백신 품목허가 제출 ... 393
• 제 10 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 394
• 제 1 절 연차별 연구개발 목표 및 달성도 ... 394
• 제 2 절 산업화 방향 ... 401
• 제 3 절 특허분석 측면 ... 402
• 제 4 절 논문분석 측면 ... 403
• 제 5 절 제품 및 시장분석 측면 ... 404
• 제 11 장 참고문헌 ... 405
• 연구개발보고서 초록 ... 417
• 끝페이지 ... 419