보고서 정보
주관연구기관 |
한국생명공학연구원 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2011-02 |
과제시작연도 |
2010 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201400000498 |
과제고유번호 |
1395019803 |
사업명 |
바이오그린21 |
DB 구축일자 |
2014-05-07
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201400000498 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
형질전환에 흔히 사용되는 항생제 저항성 유전자는 환경위해성 또는 동물위해성을 초래할 수 있어 이를 이용하여 제작된 형질전환체의 산업화를 위한 위해성 및 안전성 평가에 많은 시간과 비용이 요구되는데, 본 과제에서는 원하는 유전자 (농업 형질개선용 유전자)만이 도입된 형질전환 식물체를 개발하기 위한 기술을 확보하고 이를 활용한 형질전환체를 제작하여 조기에 품종화할 수 있는 기반을 마련하였다. 또한 연구팀에서 확보하고 있는 유용 유전자를 형질전환에 활용하였으며, 신규 유용 유전자를 다수 확보하여 형질전환에 이용하고
Ⅳ. 연구개발결과
형질전환에 흔히 사용되는 항생제 저항성 유전자는 환경위해성 또는 동물위해성을 초래할 수 있어 이를 이용하여 제작된 형질전환체의 산업화를 위한 위해성 및 안전성 평가에 많은 시간과 비용이 요구되는데, 본 과제에서는 원하는 유전자 (농업 형질개선용 유전자)만이 도입된 형질전환 식물체를 개발하기 위한 기술을 확보하고 이를 활용한 형질전환체를 제작하여 조기에 품종화할 수 있는 기반을 마련하였다. 또한 연구팀에서 확보하고 있는 유용 유전자를 형질전환에 활용하였으며, 신규 유용 유전자를 다수 확보하여 형질전환에 이용하고자 하였다.
1) 마커-프리 형질전환 시스템 확립
선발마커 제거용 형질전환 벡터(pSYCAN, pSYCAH, pTSYCAN1, pTSYCAH1)를 제작하였으며, 이들 형질전환 벡터는 특정 물질 (tunicmycin)의 처리에 의한 선발마커 제거 또는 특정 발달 시기 (tapetum specific 프로모터, TA29 프로모터)를 사용하여 화분발달 과정 중에 선발마커 cassette가 제거될 수 있도록 제작하였다.
이와 같은 형질전환벡터는 유용유전자의 형질전환체 제작에 이용되었는데 선발마커 제거용 벡터 pSYCAN 및 pSYCAH을 활용하여 crtW 유전자를 도입하기 위한 형질전환 벡터를 제작하였으며, 이를 이용하여 형질전환 애기장대를 제작한 후 선발마커를 이용한 선발, 선발 마커의 제거 및 역선발의 과정을 거쳐 선발마커가 제거된 형질전환체를 확보하였고 이를 통해 선발마커 제거 시스템을 확립하였다.
2) 유용 유전자 발굴/기능 검정 및 형질전환 벼 제작
AtDof5.1, 벼 Dof5.1, APUM4, Os03g61560, OsRBP3 의 기능을 중점적으로 확인하였다. AtDof5.1과 벼 Dof5.1은 애기장대와 벼의 잎 발달과 형태, 극성 형성에 관여하며, 과발현 시 리그닌이 줄어드는 현상을 보였다. APUM4와 Os03g61560은 애기장대와 벼의 ortholog로 각 유전자의 돌연변이체는 수정 후 치사현상을 보이며, rRNA 프로세싱과 전사체 분해에 관여 하였다. OsRBP3는 종자의 크기를 조절하는 유전자로 판단되었다. 또한 제1세부과제에서 제작한 HOB2 유전자 marker-free 벡터(pSYCAH-HOB2)의 형질전환 벼를 35개체 얻었다.
3) 화본과 작물에서의 선발마커 제거 시스템 확립 및 대량 형질전환 작물 개발
본 연구에서는 위치특이적재조합유전자 (site specific recombination) Cre/loxP와 음성선발 맠러로 이용되는 argE 유전자를 탑재한 pSYCAH를 이용하여 마커프리 형질전환체 개발을 위해 수행되었다. 본 vector에 탑재된 Cre 유전자는 재분화 단계에서 tunicamycine 처리에 의해 발현되어 양성선발마커 유전자이 hpt gene을 제거하는 기능을 하며, Cre 유전자에 의해 hpt gene이 제거되지 않는 경우 argE gene에 의해 음성선발 되도록 하였다. argE 유전자를 이용한 음성선발을 위해 상용화되고 있는 phophinotricin (PPT)을 acetic acid anhydride와 tetrahydrofuran (THF)를 이용하여 아세틸화 함으로서 N-AcPt를 생산한 후 이를 기질로 이용하였다. PPT가 식물세포에 독성을 보이는 반면 아세틸화된 N-AcPt는 비독성이었다. N-AcPt가 벼 종자발아에 미치는 영향을 구명하기 위해, wild type의 벼 종자와 argE-hpt gene 형질전환 벼 종자에 5~30 mg/L의 N-AcPt를 처리하였다. N-AcPt가 wild type 벼종자에 비독성을 보인 반면, 형질전환 벼 종자의 경우 배지에 첨가된 N-AcPt 농도에 따라 30~40%의 종자가 발아하지 못하였다. 또한 argE gene을 갖는 형질전환캘러스이 선발과 재분화 단계에서 25~30 ppm을 처리하여 약 50여 개체의 형질전환체를 획득하였으며, PCR 분석결과 목적유전자인 HOB1은 포함되어 있으나 hpt gene, argE gene 및 Cre gene은 확인되지 않았다.
Abstract
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IV. Results of the research project
1) Transformation method for selection marker-gene removal
The plant expression vectors (pSYCAN, pSYCAH, pTSYCAN and pTSYCAH) containing marekr-removal cassette were constructed. Treatment of tunicamycin could be used to induce the expression of Cre recombi
IV. Results of the research project
1) Transformation method for selection marker-gene removal
The plant expression vectors (pSYCAN, pSYCAH, pTSYCAN and pTSYCAH) containing marekr-removal cassette were constructed. Treatment of tunicamycin could be used to induce the expression of Cre recombinase during transformation in pSYCAN of pSYCAH. Otherwise TA29 promoter derived from tobacco which had specific activity in tapetum tissue could induce the Cre recombinase during pollen development in pTSYCAN and pTSYCAH.
Expression cassette containing crtW gene, which could synthesize keto-carotenoid from carotenoid, fused to pSYCAN or pSYCAH to establish marker-removal system in arabidopsis. The marker-free transgenic plants containing gene-of-interest without marker gene were generated through three steps of work, 1) selection of T0 plants using antibiotics, 2) marker-removal by tunicamycin treatment, and 3) negative selection of transgenic plants using acetylated phosphinotricin.
2) Isolation and characterization of novel genes from plants for development of transgenic plants
The function of AtDOF5.1, rice Dof5.1, APUM4, Os3g61560 and OsRBP3 in plants were characterized. AtFDof5.1 and rice Dof5.1 have functions in leaf development and leaf morphology, and its overexpression resulted in reduced lignin contents of plants. The APUM4 from Arabidopsis and Os3g61560 from rice function in processing and degradation of transcripts of rRNA, and its knock-out mutants were lethal after fertilization. It showed that OsRBP3 had function in control of seed size.
3) Development of marker-free transgenic Gramineae plants
This research was conducted to produce selectable marker free transgenic rice by Agrobacterium-mediated transformation using pSYCAH vector which constructed with Cre/loxP genes and argE gene. In regeneration stage of transgenic callus, hpt gene was removed by expression of Cre gene with tunicamycine treatment. If this positive selectable marker gene was not be successfully removed, this gene could be removed by negative selection with argE, ornithine deacetylase gene. For negative selection with argE gene, N-AcPt, which is a substrate of ornithine de acetylase, was organically acetylated with tetrahydrofuran (THF) and acetic acid (AcOH) anhydride from commercial L-Phosphinotricin. In toxicity test, L-PPT showed cyto-toxic but N-AcPt did not. In order to identify the toxic effect of N-AcPt to seed germination, non-transgenic and argE-hpt transgenic rice seeds were treated with various concentrations of N-AcPt from 5 mg/L to 30 mg/L. In germination test, toxic effect were not observed in WT seeds, however, in argE-hpt transgenic T1 seeds, 30~40% seeds could not be germinated depending on the medium. Furthermore, in selection and regeneration stages of argE-transgenic callus, calli were successfully selected with 25~30 ppm of N-AcPt. Treating with 0.1 mg/L of tunicamycine in regeneration stage, approximately 50 independent transgenic rice were obtained. In results of PCR analysis, HOB1, which is target gene, was identified in the plants, however, positive (hpt) and negative (argE) selectable marker genes and recombinase (Cre) gene were not.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 3
- SUMMARY ... 7
- CONTENTS ... 10
- 목 차 ... 11
- 제 1 장 서 론 ... 12
- 제 2 장 국내외 연구개발 현황 ... 14
- 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 16
- 제 1 절 선발 마커 제거용 형질전환 벡터 제작 및 활용 ... 16
- 제 2 절 마커프리 형질전환 벼 개발 ... 23
- 제 3 절 화본과 작물에서의 선발마커 제거 시스템 확립 및 대량형질전환 작물 개발 ... 30
- 제 4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 46
- 1절 : 목표대비 대외달성도 ... 46
- 2절 : 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타) ... 47
- 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 51
- 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 52
- 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 53
- 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비현황 ... 54
- 제 9 장 참고문헌 ... 55
- 끝페이지 ... 57
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