초록 ▼

□ 과제명 : 무균돼지의 질병 모니터링 기술 확립
▶ 연구목적 : 무균돼지 및 바이오신약/ 장기 생산용 돼지의 안전성 점검
○형질전환 기술을 이용한 새로운 질병제어 기법 연구
○ 무균 돼지 및 사육환경에서 병원체 검색 기법 확립
▶ 주요연구내용
○ 1세부과제명 : 무균돼지의 바이러스성 질병의 모니터링 기술 확립
1. 장기 생산용 돼지의 안전성 점검
○ 무균돈사 모니터링 및 SPF 돼지 사육시설 내 바이러스 모니터링
- 장기이식용 무균돼지의 안전성을 확보하기 위하여 모니터링 기술확립하여 무균

□ 과제명 : 무균돼지의 질병 모니터링 기술 확립
▶ 연구목적 : 무균돼지 및 바이오신약/ 장기 생산용 돼지의 안전성 점검
○형질전환 기술을 이용한 새로운 질병제어 기법 연구
○ 무균 돼지 및 사육환경에서 병원체 검색 기법 확립
▶ 주요연구내용
○ 1세부과제명 : 무균돼지의 바이러스성 질병의 모니터링 기술 확립
1. 장기 생산용 돼지의 안전성 점검
○ 무균돈사 모니터링 및 SPF 돼지 사육시설 내 바이러스 모니터링
- 장기이식용 무균돼지의 안전성을 확보하기 위하여 모니터링 기술확립하여 무균돼지 및 형질전환돼지의 장기와 비강과 항문swab 샘플에서 바이러스 및 기생충 검사와 병리조직학적 검사를 실시하여 질병의 원인을 밝힘
2. 무균돼지의 질병을 일으키는 원인체 분석 및 진단, 예방 기법 개발
◦ 정확하고 빠른 진단을 위한 Multiplex PCR, RT-PCR 기법의 확립 및 적용
-Porcine teschovirus에 대하여 nested RT-PCR을 실시하였으며 porcine enterovirus로 구분되던 3개 group의 바이러스의 동시 진단을 위하여 각 바이러스의 5‘NTR 부위를 target으로 하는 multiplex RT-PCR을 개발
-기 개발된 PERV DPO based multiplex PCR의 돼지 미토콘드리아 DNA를 검출하는 프라이머를 돼지의 GAPDH mRNA를 검출하는 프라이머로 대체하여 PERV RNA를 검출하는 multiplex RT-PCR로 변형시킴
- 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스의 N gene을 타겟으로 하는 프라이머를 제작하여 RT-PCR 방법을 개발
3.형질 전환 기술을 이용한 새로운 질병제어 기술 확립
○ Transfection기술의 다양한 응용
-형질전환 기술을 확립하기 위해 in-vitro상에서 transfection방법 중에 Lipofectamine reagent(invitrogen)로 reverse 방식과 electronic을 이용해 transfection 시키는 기술을 연구하였고 siRNA, shRNA기술을 적용하여 gene을 knockdown 하여 transgenic cell line을 생산하기 위해서 응용
○ 2세부과제명 : 무균돼지 및 사육환경의 세균성 질병 모니터링 기술 확립
1. 무균돈사 환경 모니터링
◦ 실험실 내 공기 중 미생물 검사 기법을 확립
- 장소별 시간대별로 공기포집기와 자유낙하법을 이용하여 대기 중 미생물 검색
◦ 실제 SPF 돼지 사육시설 내 미생물 검사
-돼지 식수, 사료, 돈사 환경(바닥, 벽, 천정)의 미생물 모니터링
2. 돼지의 소화기 질병을 일으키는 원인체 분석 및 진단, 예방 기법 개발
◦ 장독소형 대장균 진단을 위한 Multiplex PCR 기법의 확립 및 적용
- 대장균의 배양 및 진단 기법 확립
- 장독소형 대장균 진단을 위한 Multiplex PCR 기법 확립
- 무균돼지 분리 대장균과 국내 자돈 분리주에 대한 장독소형 대장균 진단 mPCR 적용
◦ 장독소형 대장균의 역학 조사를 위한 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)기법의 확립 및 적용
- 무균 돼지 분리 대장균과 국내 자돈 분리주에 대한 PFGE 적용 및 비교
◦ 무균돼지에서 분리된 대장균의 항생제 내성 조사 기법 확립 및 적용
- 돼지에서 분리된 대장균의 항생제 내성 조사
- 항생제 내성을 보이는 균주에 대해 MIC(Minimum inhibitory concentration)실시
- 항생제 내성 대장균 진단을 위한 PCR 기법의 확립 및 적용
- 항생제 내성을 가진 대장균의 다른 균으로의 conjugation 탐지 기법 확립
◦ 장독소형 대장균의 F4와 F18 gene을 이용한 돼지 소화기질병 예방기법 확립
- 확립된 PCR기법을 이용하여 F4 및 F18 을 가지는 대장균 탐지
- heat shock 과 mechanical shearing 및 원심분리를 이용하여 F4와 F18 단백질의 정제 기법 확립
- pH-dependent, mucoadhesive한 성질을 가지는 Thiolated Eudragit microsphere를 이용하여 F4와 F18 단백질 탐지 후 in vitro, in vivo에서 이들의 면역학적 특성 조사
3. 돼지 호흡기 질병 원인체 특성 조사
◦ 돼지 흉막폐렴 원인균 분리동정 및 항생제 내성 패턴 조사
-2006~2010년에 분리된 Actinobacillus pleuropneumoniae(App) 102주의 항생제 내성 패턴을 NCCLS에 따라 17종의 항생제에 대한 disk diffusion test로 알아보았음.
-App 분리주들은 amoxicillin/clavulanic acid, cephalothin, cefiofur에 감수성이 있고, lincomycin, erythromycin, kanamycin 순으로 저항성이 있는 것으로 나타났음.

Abstract ▼

IV. Results
1. Development of effective detection methods for viral diseases in gnotobiotic pigs
(1). Improvement of previously established diagnostic methods. (Establishment of Cell lines, Development of multiplex, and quatitative assays)
a. Development of multiplex PCR using dual primming

IV. Results
1. Development of effective detection methods for viral diseases in gnotobiotic pigs
(1). Improvement of previously established diagnostic methods. (Establishment of Cell lines, Development of multiplex, and quatitative assays)
a. Development of multiplex PCR using dual primming oligonucleotide system (DPO)
b. Establishment of multiplex RT-PCR for the detection og PERV RNA
1) Designing of the specific primer sets targeting envelope genes A, B and C of PERV
c. Development of detection method for Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis Virus (PHEV)
1) By using RT-PCR targetting PHEV N gene, the nested PCR was 10 times more sensitive than PCR.
d. Establishment of cell line for the diagnostic purpose of porcine viruses
1) Establishment of primary cells from lung, liver, kidney and testis of 1 day old miniuture pigs and potential use for transgenic pigs
e. Identification method of unknown pathogens based on random PCR
1) Identification of a novel single stranded circular DNA virus from bovine stool using random PCR based approach.
2. Epidemiological analyses of viral transmission and evolution to establish SOP for disease monitoring
a. Dynamic and evolution of PRRSV
1) Investigation of dynamic and evolution of PRRSV in a swine farm based on the RT-nested PCR and advanced genetic analysis.
b. Identification of Porcine Kobuvirus for Korean pigs
1) Porcine kobuvirus was detected from 87 of 167 fecal samples and its detection rate was 84.5% in the diarrheic pigs which was significantly higher than normal pigs (19.3%)
c. Epidemiological study of Porcine circovirus type 2 (PCV2) in Korea
1) The phylogenetic study using 13 Korean PCV2 genomes and the other references showed that there were 12 PCV2b and 1 PCV2a subtypes. There was evidences for recombination between PCV2a and PCV2b in two PCV2 genomes, PF163 and C7201-1
d. Detection of Porcine norovirus and sapoviruses
1) Test of the viruses from fecal RNA of pigs with or without diarrhea
3. Using transgenic technology to establish a new disease control technologies
a. A variety applications of Transfection technique
1) Reverse transfection method was higher efficiency than forward transfection. There was 70% efficiency of the siRNAs transfection to the PK15 cells
b. Analysis of siRNAs Transfected efficiency through RT-PCR and Real-Time PCR
1) Detection knockdown efficiency up to 90% of PERV mRNA when the target region was both gag and pol mRNA sewuence
2) Detection knockdown efficiency up to 75% of PERV pol2 and gag2 mRNA level c. RT-Activity Analysis
1) We could found knock-down efficiency up to 70% of PERV pol2 mRNA when the target region was supposed to be at 4093~4111bp
4. Development of monitoring methods about bacterial disease in SPF pigs
1. Development of air-monitoring method about bacterial disease in SPF pig environment
1) Establishment of air-monitoring method about bacterial disease in laboratory as a pre-experiment
a. Measurement of number of bacterial colony and analysis of causing agent in laboratory for different places and times using air-sampler and fall-down method
2) Air-monitoring in SPF pig breeding environment with developed method
a. Measurement of number of bacterial colony in different places in pig environment using air-sampler and fall-down method based on developed method and analysis of causing agents and their antibiotic resistant patterns
2. Development of monitoring method about bacterial disease in SPF pig environment
1) Monitoring of bacterial agent in feed and water
a. The number of bacterial colony from water was reduced after sterilization and E nterococcus faecium was continuously detected from feeds.
2) Monitoring of environment in each place in SPF pig facility
a. Non-pathogenc bacteria was detected in several places such as entrance and easily　contaminated places
3. Development of monitoring method about bacterial disease in nasal and fecal samples from breeding pigs and organs from dead pigs
1) Isolation of bacterial agent from nasal and fecal samples of breeding pigs and organs of dead pigs and culture them and investigation.
a. The detected bacterial agents were quite various and commensal in environment such as soil and water and non-pathogenic. E nterococcus faecium and E . coli were mostly detected from nasal samples and E . coli and P roteus mirabilis was frequentlydetected from fecal samples.
b. From organs of dead pigs, various bacterial agents were detected and most of them were non-pathogenic and commensal. M icrococcus luteus/ lylae from uterus and E . coli from other organs were most frequently detected.
c. Most pathogens were susceptible to penicillin and erythromycin after antibiotic resistant test. These antibiotics will be helpful to sterilize SPF pig facilities.
4. Development of detective, diagnostic and preventive method against gastrointestinal disease causing agent
1) Development of multiplex PCR method for diagnosis of ETEC
a. Out of 10 E . coli isolates from SPF pigs, 5 isolates for F1 and 4 isolates for F1 and EAST1 were positive. The 4 isolates positive for F1 and EA ST1 were diagnosed as potential ETEC.
2) Development of PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) method for epidemiological investigation of ETEC
a. One E . coli isolate from SPF pig showed high similarity with one E . coli isolate from conventional pig by PFGE method.
3) Development of detection method about antibiotic resistant pattern of gastrointestinal disease causing agent in pigs
a. Establishment of specific primers targetting DNA gyrase active site(gyrA and gyrB) and topoisomerase active site (parC and parE) which are inhibited by quinolone
b. A ll Escherichia fergusonii isolates were shown to have TEM-1 gene which was successfully transfered between bacteria.
4) Development of preventive method against gastrointestinal disease in pigs using F4 and F18 fimbriae of ETEC
a. Two isolates (2.4%) and 9 isolates (10.8%) out of 83 E. coli isolates from pigs with diarrhea were positive for F4 and F18, respectively.
b. Purification of F4 and F18 protein and loading in oral vaccine delivery system
c. The vaccine was shown to have immune stimulating activity by increasing NO, TNF-α, IL-6 and IFN-γ in in vitro assay
d. The vaccine also induced mucosal and systemic immune response in vivo experiment with high IgA and IgG titer after oral immunization to mice
5. Investigation of feature of respiratory pig disease causing agent
1) Investigation of antibiotic resistant patterns of Actinobacillus pleuropneumoniae (A pp) 102 isolates from 2006 to 2010 by disk diffusion test for 17 antibiotics according to NCCLS
a. App isolates which are resistant to Florfenicol, Kanamycin, Ampicillin and Amoxicillin were increasing and the number of antibiotics which one isolate showed resistant was also increasing.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 13
• 제1장 서 론 ... 23
• 제1절 연구개발의 최종 목적 ... 24
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 24
• 제3절 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 24
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 26
• 제1절 국내 기술개발 현황 ... 26
• 제2절 국외 기술개발 현황 ... 26
• 제3절 국.내외 기술개발 한계, 문제점과 차지하는 위치 ... 27
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
• 제1절 무균돼지의 바이러스 질병의 효율적인 탐지기법 확립 ... 29
• 제2절 질병모니터링 SOP 구축을 위한 전파 역학 및 진화 속도 분석 ... 36
• 제3절 형질 전환 기술을 이용한 새로운 질병제어 기술 확립 ... 43
• 제4절 무균돼지 세균성 질병제어 기술 확립 ... 48
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 100
• 제1절 목표대비 달성도 ... 100
• 제2절 정량적 성과 ... 100
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 112
• 제1절 연구의 개발의 필요성 ... 112
• 제2절 연구의 활용분야 ... 112
• 제3절 연구의 활용방안 ... 113
• 제4절 추가 연구 ... 113
• 제6장 중요 변동사항 ... 114
• 제7장 참고문헌 ... 115
• <참고 1> 연차평가 지적사항 및 조치결과 ... 122
• <참고 2> 주요연구 성과 ... 123
• 주요 결과 요약서 ... 132