보고서 정보
주관연구기관 |
농림수산검역검사본부 |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2012-11 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201400001113 |
과제고유번호 |
1545003609 |
사업명 |
수의과학기술개발연구 |
DB 구축일자 |
2014-08-16
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키워드 |
브루셀라.DNA백신.개브루셀라병.B. canis.
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초록
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5. 최종 연구결과 요약
○ B rucella canis의 DNA백신 유전자 선발 및 DNA백신용 벡터 작성
가. 2DE기법 및 개브루셀라 양성혈청을 이용하여 omp31, omp25, groEL, hisD, L25, aldA, NUDT21, sodC, TRAP, rpI L, ribH, omp16, omp28과 omp31b의 총 15개 단백질을 선발하여 DNA백신용 벡터 작성하였고 in vitro 수준에서 발현을 확인하였음
나. 선발된 단백질 중 12개 후보유전자의 재조합단백질을 생산하고 Western 분석을 이용하여
5. 최종 연구결과 요약
○ B rucella canis의 DNA백신 유전자 선발 및 DNA백신용 벡터 작성
가. 2DE기법 및 개브루셀라 양성혈청을 이용하여 omp31, omp25, groEL, hisD, L25, aldA, NUDT21, sodC, TRAP, rpI L, ribH, omp16, omp28과 omp31b의 총 15개 단백질을 선발하여 DNA백신용 벡터 작성하였고 in vitro 수준에서 발현을 확인하였음
나. 선발된 단백질 중 12개 후보유전자의 재조합단백질을 생산하고 Western 분석을 이용하여 면역원성을 조사한 결과 SodC(18.1 kDa), TRAP(34.1), L7/L12(12.4), Omp16(18.1), Omp31(25.3), Omp25(23.1), GroEL(57.5), Omp28(26.5), Omp31b(27.7)에서 반응이 나타남
○ 마우스를 이용한 DNA백신 효능 평가
가. 13개의 DNA 백신 후보주(50㎍)를 단독 혹은 peptide adjuvant인 CpG와 함께 2주 간격으로 3회 마우스 근육에 접종하고 면역반응(IgG1, IgG2a, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF)과 마우스 방어효과를 분석하여 TRAP, rpI L, omp31, groEL, sodC, hisD, aldA 항원을 선발함
나. 2차 시험을 3가지 접종방법(1군 재조합단백질 접종군, 2군 재조합단백질과 DNA백신 혼합접종군, 3군 DNA백신접종군)으로 수행하였음. rplL은 모든 군에서 평균이상의 높은 IgG1과 2-3군에서 높은 IgG2a 항체를 유도하였고 groEL은 1-2군에서 높은 IgG1과 IgG2a 항체발현을 유도하였으며 sodC는 1군의 IgG2a 항체만을 평균 이상으로 발현시켰고, 공격접종한 결과 groEL이 접종된 1군과 3군에서 음성처리구에 비하여 적은 균수가 관찰되어 최종적으로 rplL, groEL, sodC가 선정되었음.
다. Dual genetic adjuvant GI(GM-CSF::IL-2)를 minor antigen인 sodC, rplL, groEL에 연결하여 융합 유전자를 작성. 즉 GI를 rplL의 앞과 뒤로 연결하여 융합 유전자 만들어서 omp28과 omp31b에 혼합하여 실험한 결과 양쪽 처리구에서 높은 수치의 total IgG antibody가 4주에 증가하고 8주에 감소하는 양상을 보였고 omp28은 omp31b를 혼합하여 접종한 처리구보다 높은 IgG1과 IgG2a를 유도하였음. splenocyte을 이용한 cytokine assay에서 omp28에 rplL과 GI를 혼합한 것에 비하여 융합하여 접종한 처리구에서 높게 측정되었으나 omp31b는 IFNγ를 유도하지 못함. 또한 TNFα와 IL-6도 같은 경향을 보였으나 IL-2는 영향을 받지 않았음. 또한 마우스 공격접종에서 omp28을 단독 혹은 rplL과 GI를 혼합 또는 뒤로 융합한 것을 함께 접종한 처리구에서 음성 처리구보다 적은 균수가 측정되었음.
라. 선발된 항원(omp28, omp31, GI::rplL, sodC, groEL)을 접종 간격과 접종 양을 조절하여 실험을 진행한 결과 접종 양(50∼100㎍)에 따른 뚜렷한 차이를 보이지 않았으며 GI::rplL, omp28, groEL에서 total IgG, IgG1 및 IgG2a가 증가하였으나 omp28과 groEL은 단독 처리군과 달리 세 개 또는 네 개 혼합 처리군은 조합에 따라 항체가 형성되지 않았음. splenocyte을 이용한 cytokine assay에서 GI::rplL을 단독 처리구에 비하여 비교적 혼합 처리군에 IFNγ, IL-2, IL-6, TNFα의 높은 수치를 확인하였으나 omp31b는 유도하지 못함. IL-4는 모든 처리구에서 자극되지 않았음. 마우스 공격접종에서 omp28, GI::rplL, groEL에서 음성 처리구보다 적은 균수가 측정되었음.
마. Genetic adjuvant(GI)를 선발된 항원(omp28, groEL)에 앞•뒤로 연결하여 제작하고 dual antigen(omp28::rplL)를 혼합하여 RB1 생균백신과의 효능비교시험 진행 중(5차 실험)
목차 Contents
- 총괄요약표 ... 1
- 연구과제 최종결과보고서 ... 3
- Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 3
- Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 5
- Ⅲ. 연구결과 ... 7
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 28
- Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 29
- Ⅶ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 29
- Ⅷ. 주요연구과제 변경사항 ... 29
- IX. 참고자료 ... 30
- 끝페이지 ... 30
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