초록 ▼

□ 유전자진단법 확립
∘ OIE 진단프라이머 및 기존 발표되었던 프라이머 작성 및 진단조건 확립
∘ 폭스바이러스 검출용 특이 진단 프라이머 작성
- 폭스바이러스 P32 유전자 부위를 이용하여 산양두, 양두 및 럼피스킨 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 진단 프라이머 작성 및 조건설정
∘ 유저자진단법 유효성 평가
- 민감도 : 작성된 프라이머는 산양두 바이러스 1pg, 양두바이러스 9pg, 럼피스킨바이러스 6pg까지 검출하였으며 OIE 진단 프라이머보다 민감하였음
- 특이도 : 감별진단이 필요한 전염성

□ 유전자진단법 확립
∘ OIE 진단프라이머 및 기존 발표되었던 프라이머 작성 및 진단조건 확립
∘ 폭스바이러스 검출용 특이 진단 프라이머 작성
- 폭스바이러스 P32 유전자 부위를 이용하여 산양두, 양두 및 럼피스킨 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 진단 프라이머 작성 및 조건설정
∘ 유저자진단법 유효성 평가
- 민감도 : 작성된 프라이머는 산양두 바이러스 1pg, 양두바이러스 9pg, 럼피스킨바이러스 6pg까지 검출하였으며 OIE 진단 프라이머보다 민감하였음
- 특이도 : 감별진단이 필요한 전염성농피증바이러스(OrfV)는 검출하지 않음
□ 항체진단법 확립
∘ 진단항원의 선발
- 진단항원으로 면역원성이 높은 P32부위를 선정하고 곤충세포 및 대장균 발현시스템을 이용해 재조합 P32단백질을 생산 및 정제하였으나 소량만이 발현되었으며 대부분이 insoluble한 형태로 세포내 존재하여 진단항원으로 사용이 적절치 않았음
- 최근 연구되고 있는 ORF 5개 부위를 선정하여 발현을 시도하였으나 발현되지 않았음
- 항원성이 높을것으로 예상되는 펩타이드 6개 부위를 선정하여 ELISA를 실시한 결과 불활화 바이러스 항원 ELISA에 비해 민감도가 떨어짐
- 최종적으로 불활화 바이러스를 진단항원으로 선발하였음
∘ 일자별 표준양성혈청 패널 생산
- 진단법 평가를 위해 염소 및 양에 바이러스를 접종하여 일자별 혈청을 생산
- 생산된 일자별 혈청은 웨스턴블로팅, 중화시험, ELISA 등을 실시하여 평가하였음
∘ 단클론 항체의 생산 및 특성평가
- 대장균 발현 시스템에서 재조합 P32 단백질을 생산한 후 이를 마우스에 접종하여 총 29개의 단클론 항체를 생산하였음
- 생산된 단클론항체는 항원특이성(isotype) 및 ELISA 등을 실시하여 특성을 확인
- 단클론항체 특성 확인결과 양성혈청과 경쟁반응을 나타내지 않아 최종 선발된 진단항체가 없음
∘ 항체진단법 구축
- 폭스바이러스 항체진단을 위해 불활화 바이러스 항원을 이용한 간접 ELISA(Inidrect ELISA; I-ELISA) 방법을 확립하였음
- 진단법 희석배수는 바이러스 항원 1/40(2×107/ml TCID50), 염소혈청 1/100, 소 혈청 1/10으로 설정
- 국내사육중인 소(640두) 및 염소(300두) 음성혈청을 이용하여 Positive Percent(PP) cut-off를 구한 결과 소 44.4, 염소 32.1로 설정
- 진단법의 민감도는 100%, 특이도는 95.1%, 효율은 95.3% 였음
- 소모기매개질병 양성혈청을 이용하여 특이도 실험결과 모두 음성으로 교차반응을 나타내지 않았음
- 진단법 평가를 위해 일자별 양성혈청패널을 이용한 결과 I-ELISA에서는 10일째, 중화시험에서는 14일째 항체양성전위(seroconversion)를 검출하였음, 즉 I-ELISA의 민감도가 중화시험법보다 높음을 확인하였음
- 음성혈청 및 일자별 양성혈청패널을 이용한 진단법의 민감도는 100%, 특이도는 93.7% 였음
- 펩타이드 항원을 이용한 ELISA와 비교한 결과 I-ELISA의 민감도가 더 뛰어났음.

Abstract ▼

Title (1st subtitle) : Expression of P32 protein of sheep pox virus using baculovirus expression system
Results : We expressed recombinant P32 proteins in insect cells using baculovirus system. Recombinant P32 protein was detected a specific band(32kDa) in western blotting and reacted with caprip

Title (1st subtitle) : Expression of P32 protein of sheep pox virus using baculovirus expression system
Results : We expressed recombinant P32 proteins in insect cells using baculovirus system. Recombinant P32 protein was detected a specific band(32kDa) in western blotting and reacted with capripox virus antisera in IFA.
Title (2nd subtitle): Establishment of PCR method detected for capripox viruses in Korea
Results : Capripox virus was efficiently propagated in OA3·Ts cells. Virus titer was higher than10⁵TCID₅₀.Capripoxviruswasdetecteda192bp,980bp,149bp,289bpusingatargetforattatchmentprotei n,P32,DrBp,Invertedterminalrepasts.
Title (2nd subtitle) : Production of monoclonal antibodies against Capripox virus application for rapid diagnosis tests in animal sera
Results : We expressed recombinant P32 proteins in E.coli. Recombinant P32protein was detected a specific band(32kDa) in westernblotting and reacted with capripoxvirus antisera in IFA. A total of 29 antibodies were produced. Mab 66D7 has a good reactivity with capripox virus then selected as a antibody for using a C-ELISA.
Title (2nd subtitle): Development of PCR method for capripox viruses in Korea
Results : Capripox virus was efficiently propagated in OA3·Ts cells. Virus titer was higher than 10⁵TCID₅₀. Capripoxvirus was detected a 172bp and more sensitive than OIEprimer. Detection limit of SPV, GPV, LSDV is a 1pg, 9pg, 6pg, respectively.
Title (2nd subtitle) : Development of diagnostic method for capripox viruses in Korea
Results : Capripox virus was efficiently propagated in OA3·Ts cells. In conventional PCR, capripox virus was detected a 172bp and more sensitive than OIE primer. Recombinant P32 protein was expressed in E.coli and detected a specific band(32kDa) in western blotting. Also recP32 was reacted with capripox virus antisera in IFA. A total of 29 antibodies were produced.

목차 Contents

• 총괄요약표 ... 1
• 연구과제 최종결과보고서 ... 3
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 3
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 4
• Ⅲ. 연구결과 ... 5
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 18
• Ⅴ. 고 찰 ... 19
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 20
• Ⅶ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 21
• Ⅷ. 주요연구과제 변경사항 ... 21
• IX. 참고자료 ... 21
• Ⅹ. 영문초록 ... 23
• 끝페이지 ... 27