초록 ▼

본 연구는 그람음성 내독소(LPS)와 결합하여 TLR4 매개 염증반응을 촉진하여 쇼크를 유발하는 것으로 밝혀진 핵단백 HMGB1의 결합 부위를 mapping하여 중화 펩타이드 규명하고 그 효과를 평가하고자 하였으며 다음과 같은 결과를 얻었음.
1. HMGB1 단백질의 LPS 결합 도메인 규명: Biotin이 결합된 LPS를 이용하여 His-tagged HMGB1 A box (aa 1-79) 및 His-tagged B box (aa 88-162) 단백질과의 결합 여부를 측정한 결과 B box 단백질이 LPS와 주로 결합하며 A

본 연구는 그람음성 내독소(LPS)와 결합하여 TLR4 매개 염증반응을 촉진하여 쇼크를 유발하는 것으로 밝혀진 핵단백 HMGB1의 결합 부위를 mapping하여 중화 펩타이드 규명하고 그 효과를 평가하고자 하였으며 다음과 같은 결과를 얻었음.
1. HMGB1 단백질의 LPS 결합 도메인 규명: Biotin이 결합된 LPS를 이용하여 His-tagged HMGB1 A box (aa 1-79) 및 His-tagged B box (aa 88-162) 단백질과의 결합 여부를 측정한 결과 B box 단백질이 LPS와 주로 결합하며 A box 단백질도 LPS와 약하게 결합함을 관찰함. A box 및 B box 단백질은 각각 detoxified LPS (polysaccharide 부위)와 결합하고 B box 부위는 lipid A 부분은 결합함을 알 수 있었음.
2. LPS 결합 HMGB1 단백질 부위 동정: LPS와 결합하는 HMGB1 단백질 부위를 동정하기 위하여 biotin이 결합된 펩타이드를 합성하여, LPS와 결합시켜 본 결과 두 부위 (펩타이드 1과 6번)가 LPS와 결합함을 알 수 있었으며, ELISA 방법으로도 동일한 결과를 확인함. 이 결합은 competition ELISA를 통하여 특이성을 확인한 결과 펩타이드1(HPep1)은 LPS의 polysaccharide 부위와 펩타이드6(HPep6)는lipid A부분과 결합함을 관찰하였음. 또한 펩타이드 1과 6번는 LPS와 LBP의 결합을 억제함으로써 LPS 매개 염증반응을 차단할 수 있는 기능이 있음을 확인함.
3. HMGB1 펩타이드 1 및 6의 LPS transfer 능력 여부: 펩타이드 1 및 6가 LPS를 CD14로 transfer하는 능력이 있는 지를 확인하기 위하여 LPS transfer assay를 시행한 결과 펩타이드1 및 6 자체는 LPS transfer 능력이 없으며, 오히려 LPS의 CD14로 transfer를 억제하는 기능이 있음을 in vitro 실험, RAW264.7 세포를 이용한 실험을 통해 확인함. 이 결과를 볼 때 펩타이드 1 및 6는 LPS의 CD14으로의 transfer 과정을 억제하며 LPS에 의한염증반응을 차단하는 효과가있음을 알 수 있었음.
4. 사람 말초혈액에서 HMGB1 펩타이드 1 및 6에 의한 LPS 매개 TNF-α 생성 억제 효과를 관찰하기 위하여 사람 말초혈액을 LPS로 자극할 때 펩타이드 1 및 6를 첨가하여 TNF-α의 생성 억제 정도를 비교함. 그 결과 펩타이드 1 및 6가 LPS매개 TNF-α 생성 억제능력이 있음을 알 수 있었음.
5. Subclinical endotoxemia 마우스 모델에서 HMGB1 펩타이드 1 및 6의 염증반응 억제 여부를 관찰하기 위하여 LPS와 HMGB1 펩타이드 1 혹은 6를 주입하고 혈청내 TNF-α의 생성 정도를 관찰함. 그 결과 펩타이드 1 혹은 6는 LPS에 의한 TNF-α의생성을 줄임을 관찰할 수 있었음.
이상의 결과를 요약하면 HMGB1 단백질내 두 군데의 LPS 결합부위를 규명하였으며, 이 두 결합부위를 포함하는 펩타이드는 LPS를 중화시키는 성질이 있을 뿐만 아니라 ex vivo 및 in vivo에서 LPS 매개 TNF-α 생성을 억제하는 성질이 있음을 관찰함. 이는 그람음성 내독소(LPS)에 의한 염증반응 혹은 패혈증의 중요한 치료 후보제로 사용 가능성을 제시함. 추후에 추가적인 동물 실험을 통하여 그 치료제로의 가능성을 조사하고자 함.

Abstract ▼

Lipopolysaccharide (LPS) triggers deleterious systemic inflammatory responses when released into the blood circulation, causing severe sepsis, organ dysfun ction, and death. LPS binding components in the serum play an important role in modifying LPS toxicity by facilitating its interaction with the

Lipopolysaccharide (LPS) triggers deleterious systemic inflammatory responses when released into the blood circulation, causing severe sepsis, organ dysfun ction, and death. LPS binding components in the serum play an important role in modifying LPS toxicity by facilitating its interaction with the LPS signaling receptor, which is expressed on the surface of LPS-responsive cells. We have previously shown that HMGB1 is able to bind LPS and demonstrated that this binding can increase LPS-induced TNF-α production in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). To enhance our understanding of the role of HMGB1 in LPS recognition, and to enable the design of LPS-neutralizing peptides, we investigated the domains of HMGB1 involved in binding to LPS using 12 HMGB1-derived synthetic peptides. We identified two LPS binding regions, namely HMGB13-15 (HPep1) and HMGB180-96 (HPep6), which are located in the A and B box domains of HMGB1 and bind to the polysaccharide and lipid A moieties of LPS, respectively. Both HPep1 and HPep6 inhibited binding of LPS to LBP, LBP-mediated LPS transfer to CD14, and cellular uptake of LPS in RAW264.7 cells. Both HPep1 and HPep6 inhibited LPS-induced TNF-alpha release in human PBMCs and decreased levels of TNF-alpha in the serum of a subclinical endotoxemia mouse model. Together, our results indicate that HMGB1 has two LPS-binding and neutralizing regions
that can be utilized in the design of anti-septic therapeutics.

목차 Contents

• I. 총 괄 현 황 ... 1
• 표지 ... 2
• 제출문 ... 4
• 보고서 요약서 ... 5
• 요 약 문 ... 6
• SUMMARY ... 7
• 6. 연구 성과 실적 및 향후 계획 ... 8
• 7. 참여연구원 현황표 ... 12
• II. 총괄연구과제 연구결과 ... 13
• 1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ... 14
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 15
• 3. 연구개발과제의 추진체계 ... 16
• 4. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 17
• 5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 22
• 6. 향후 연구성과 추진 계획 ... 23
• 7. 연구개발결과의 파급효과 ... 23
• 8. 연구개발결과의 활용계획 ... 23
• 9. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 24
• 10. 참고문헌 ... 24
• 끝페이지 ... 28