비소세포폐암 환자에서 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)를 이용한 제피티닙 내성 관련 유전자의 빈도 분석과 임상학적 의의 검증 A MALDI-TOF MS study of EGFR T790M mutation gene resistant to gefitinib in non-small cell lung cancer patients원문보기
연구목표 <최종목표> - EGFR tyrosine kinase 억제제인 제피티닙에 대한 대표적인 획득 내성 기전인 EGFR T790M 유전자 돌연변이의 약물 노출 이전 존재 유무와 그 빈도를 고민감도 염기 서열 분석 방법 중에 하나인 MALDI-TOF MS를 통하여 알아보고 이 유전자 돌연변이를 갖는 환자군의 병태생리적 특징을 규명하고 검증함으로써 비소세포폐암 환자의 제피티닙 치료 효과를 향상시킬 수 있는 방안을 제시한다. <당해연도목표> 1. 후향적 이행성 연구를 위한 적절한 비소세포폐암 환자 대상자 선정
연구목표 <최종목표> - EGFR tyrosine kinase 억제제인 제피티닙에 대한 대표적인 획득 내성 기전인 EGFR T790M 유전자 돌연변이의 약물 노출 이전 존재 유무와 그 빈도를 고민감도 염기 서열 분석 방법 중에 하나인 MALDI-TOF MS를 통하여 알아보고 이 유전자 돌연변이를 갖는 환자군의 병태생리적 특징을 규명하고 검증함으로써 비소세포폐암 환자의 제피티닙 치료 효과를 향상시킬 수 있는 방안을 제시한다. <당해연도목표> 1. 후향적 이행성 연구를 위한 적절한 비소세포폐암 환자 대상자 선정 2. 환자 종양 조직을 이용하여 EGFR T790M 유전자 돌연변이에 대한 MALDI-TOF MS 시행 3. 제피티닙 치료 효과 및 예후와 MALDI-TOF MS 결과 분석 4. EGFR 돌연변이 양성 비소세포폐암 세포주을 이용하여 제피티닙 내성 세포주 확립 5. EGFR T790M 유전자 돌연변이 제피티닙 내성 세포주와 민감성 세포주의 cell mixture 실험을 통하여 EGFR T790M 유전자 돌연변이의 영향을 정량적으로 측정 연구내용 및 방법 ◆ 연구내용 - EGFR 돌연변이 비소세포 폐암 환자는 EGFR tyrosine kinase 억제제인 제피티닙에 70%~ 80%의 높은 반응률을 보이지만 약 8~9개월 이후에는 획득 내성을 보이고 있으며 내성 발생 시점 또한 환자마다 개인 차이가 있어서 약 30%는 3개월 미만의 짧은 반응 기간을 보임. - EGFR 돌연변이 폐암 환자에서 각기 다른 제피티닙 효과를 보이는 원인에 대하여 EGFR T790M 유전자 돌연변이가 제피티닙 사용 이전부터 적은 수로 존재하고 있다가 제피티닙 사용 이후에 선택적으로 증폭되어 내성을 보이게 할 수 있다는 주장이 있으나 이를 뒷받침할 수 있는 검증된 임상적 데이터는 없음. - 기존의 direct sequencing 방법을 이용한 돌연변이 검사는 종양 조직 내에 소량으로 존재할 수 있는 EGFR T790M 유전자를 발견하기에는 민감도가 낮을 수 있어 이를 극복할 수 있는 다른 sequencing 방법들이 시도되고 있지만 아직까지 일관성 있는 결과를 보이지 못함. - 따라서, 종양 조직 내에 존재하는 이질적인 유전자 돌연변이들의 식별이 쉽고 적은 DNA 양으로도 측정 가능한 MALDI-TOF MS를 이용하여 EGFR T790M 유전자 돌연변이의 약물 노출 이전 존재 유무와 그 빈도를 알아보고자 함. ◆ 연구 방법 1. 후향적 이행성 연구를 위한 적절한 비소세포폐암 환자 대상자 선정 1) 2005년 1월 이전 진단 2) 조직학적 혹은 세포학적으로 확인된 비소세포폐암 4기 3) 선암종 혹은 비흡연자 4) 제피티닙 혹은 타세바를 진행된 병기에서 사용 5) 치료 전 종양 조직 검체 (조직검사 혹은 수술적 제거로 채집, 파라핀 블록으로 보관) 6) Direct sequensing method으로 the kinase domain of EGFR gene에서 exons19, exon 21L858r mutation 존재 2. 환자 조직 검체를 이용하여 EGFR 유전자에 대하여 염기서열 분석 시행 1) genotyping by MALDI-TOF MS for EGFR T790M 3. 제피티닙 치료 효과 및 예후와 MALDI-TOF MS 결과 분석 1) Active mutation (EGFR 19del, EGFR L858R)를 가진 환자군에서 resistant mutation (EGFR T790M)을 동시에 가진 환자들의 빈도를 측정 2) MALDI-TOF MS로 확인된 T790M 양성군과 음성군 사이의 EGFR-TKI 반응률과 반응 기간 비교 3) MALDI-TOF MS로 확인된 T790M 양성군에서 1차 치료제로 EGFR-TKI를 사용한 군과 2차 이상의 치료제로 EGFR-TKI를 사용한 군 간의 반응률과 반응 기간 비교 4) T790M 양성 종양의 병리생태적 특징 규명(흡연, 종양의 병기, 크기 혹은 분화도 등과의 관련성) 5) 종양 내의 EGFR T790M 분포 양에 따른 EGFR-TKI 반응 기간에 대한 효과 4. EGFR 돌연변이 양성 비소세포폐암 세포주을 이용하여 제피티닙 내성 세포주 확립 5. Cell mixture 실험에서 MALDI-TOF MS 민감도 확인 및 EGFR T790M의 영향 정량 분석 연구개발에 따른 기대성과 <정량적 성과> <정성적 성과> -임상적 발견을 실험실내에서 재현하고 그 원리, 기전을 밝혀내어 다시 임상 모델에 적용하는 모범적인 성공 사례 제시 -신진 의과학자의 연구 역량 고취
Abstract▼
1. Study objectives - Epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors (TKI) are clinically effective in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) harboring sensitizing EGFR mutations. - However, A subset of patients with sensitive EGFR mutations did not respond to EGF
1. Study objectives - Epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors (TKI) are clinically effective in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) harboring sensitizing EGFR mutations. - However, A subset of patients with sensitive EGFR mutations did not respond to EGFR-TKI therapy or their response was shorter than expected. - The cause of this reduction in the efficacy of targeted therapy in a molecularly defined patient population remains unknown. Recently, some case reports and preclinical studies have suggested that the T790M resistance mutation may exist before EGFR-TKI exposure and may play a fundamental role in the inherent resistance of EGFR-mutant tumors to EGFR-TKI therapy -The aims of this study were as follows: (i) to determine the frequency of preexisting EGFR T790M mutations in Korean patients with advanced NSCLC harboring sensitive EGFR mutations, (ii) to evaluate the clinical outcomes according to the level of the T790M mutation, (iii) to estimate the minimum frequency of the T790M mutation with in a tumor to start to negatively influence the efficacy of EGFR-TKI. In this study, the EGFR T790M mutation frequency was determined using the MS genotyping assay. 2. Study method - Advanced NSCLC patients who underwent routine direct sequencing of the EGFR gene and who were treated with an EGFR-TKI (e.g.,gefitinib or erlotinib) at the National Cancer Center Hospital were screened for this study. - Archival formalin-fixed, paraffin-embedded pretreatment tumor tissues were collected for genetic analysis. A pathologist (K.G.L) reviewed hematoxylin-eosin stained sections of each tissue sample and identified tissue areas containing ≥70% tumor for dissection. Genomic DNA was extracted from the dissected tumor tissue using a DNeasy Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA), Genotyping for the T790M mutation was done using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/MS (MALDI-TOF/MS) using the standard protocol of the MassARRAY system (Sequenom, San Diego, CA). - In vitro sensitivity to gefitinib (LC Laboratories, Woburn, MA) was measured in two pairs of cell line mixtures containing TKI - sensitive cells and TKI-resistant cells with the T790M mutation: HCC827/H1975 and PC9/PC9GR-T790M. TKI-sensitive cells and TKI-resistant cells with the T790M mutation were mixed at the indicated proportions and were treated with gefitinib for 72 hours. Growth inhibition was measured using the MTS colorimetric assay (Promega, Madison, WI). 3. Study results -A total of 124 patients with sensitive EGFR mutations were further genotyped by the MS-based assay. Most of the patients were never smokers and had adenocarcinoma histology (1) Frequency of T790M -The MS-based genotyping assay detected EGFR T790M mutations in 31 patients (25.0%). -Patient characteristics and sampling methods did not differ between the T790M-positive tumors and the T790M-negative tumors (2) Effects of the T790M mutation on EGFR-TKI efficacy -The response rate(RR) and disease control rate(DCR) were not significantly different between patients with T790M-positive mutant tumors and T790M-negative mutant tumors (RR: 71.0% vs. 83.9%, P =0.115;DCR:83.9%vs.92.5%,P =0.173). -The median time to progression (TTP) was significantly shorter in patients with T790M-positive mutant tumors than in patients with T790M-negative mutant tumors (6.3 months vs. 11.5 months; P <0.001). The shorter TTP of T790M-positive mutant tumors was also observed at the 1st line EGFR-TKI subgroup (6.0 months vs. 10.5 months ; HR 2.06, 95%CI, 0.94–4.48 ; P=0.062) and at the second-line EGFR-TKI or later subgroup (6.3 months vs. 11.5 months ; HR 2.65, 95%CI, 1.53–4.60; P =0.001). (3) Dose-dependent effect of the T790M mutation -The optimal cut-off point of T790M mutant signal frequency to give the minimum P -value for the HR of progression to EGFR-TKI in T790M-positive mutant tumors was 45.7%, which corresponded to percentages of cells within a tumor of 28.1%, based on the cell-line mixture study. Patients with T790M-positive mutant tumors were divided into two subgroups according to this cut-off value of T790M mutant signal frequency. -There was no significant difference in RR and DCR between high (n= 9) and low T790M groups (n= 22) (RR: 66.7% vs. 72.7%, P =1.000; DCR: 66.7% vs. 90.9%, P =0.131). -The median TTP was significantly shorter in high T790M patients than in low T790M patients (2.4 months vs. 6.7 months; HR 2.91, 95% CI, 1.26–6.75; P =0.009) (4) Estimated frequency of T790M mutant cells for inducing resistance -The minimum cutoff level of the T790M signal at which the risk of progression increased during EGFR-TKI therapy ranged from 2.8% to 3.4%, which corresponds to between 1.6% and 2.0% of the estimated percentage. -In vitro sensitivity to gefitinib was significantly lower in the cell mixtures containing ≥10% of H1975 cells (TKI-resistant cells) compared with that of pure H827 cells (TKI-sensitive cells). Additionally, in mixtures of PC9GR-T790M cells and PC9 cells, the minimum percentage of PC9GR-T790M cells that started to show a reduction in gefitinib sensitivity relative to pure PC9 cells was 5%.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.