초록 ▼

연구결과:
① HBx에 의한 대사성질환 유도는 간암발달과 직접적인 연관이 있음을 규명하였고 iNOS가 중요한 역할 함을 확인하였음.
◦HBx에 의해 hepatic gluconeogenesis 등의 대사성 질환병변이 증가하였으며 iNOS가 중요한 조절인자로 확인되었음.
◦HBx 마우스의 가령에 따른 대사성질환 증가는 암 발생율과 병변 진행률에 영향을 주었음.
◦MRI 방법을 통해 HBx 형질전환 마우스와 HBxTg/iNOS^-/- 마우스에서 암 크기(tumor size)를 비교한 결과, HBxT

연구결과:
① HBx에 의한 대사성질환 유도는 간암발달과 직접적인 연관이 있음을 규명하였고 iNOS가 중요한 역할 함을 확인하였음.
◦HBx에 의해 hepatic gluconeogenesis 등의 대사성 질환병변이 증가하였으며 iNOS가 중요한 조절인자로 확인되었음.
◦HBx 마우스의 가령에 따른 대사성질환 증가는 암 발생율과 병변 진행률에 영향을 주었음.
◦MRI 방법을 통해 HBx 형질전환 마우스와 HBxTg/iNOS^-/- 마우스에서 암 크기(tumor size)를 비교한 결과, HBxTg/iNOS-/- 마우스에서 유의성 있게 감소하였음.
◦HBx에 의해 조절되는 iNOS는 HBx enhancer에 있는 CRE site에 CREB를 recruit함으로 HBx의 전사를 조절하는 것으로 확인함.
② HBx에 의한 대사성질환 유도 및 간암생성 및 발달에 AMPK가 관여함을 확인하였음.
◦HBx 마우스의 DNA chip data, Proteomics data 및 문헌 분석을 통해 HBx에 의한 대사성질 환유도 및 간암발달에 연관이 있을 것으로 판단되는 단백질의 발현을 western blot으로 확인한결과, AMPK가 target 후보로 선정하였음.
◦HBV 간암환자와 HBx 마우스의 Tumor 부위에서 AMPK 유전자의 발현이 non-tumor에 비해 감소한 것을 확인함.
◦HBx가 대사질환과 암에 중요한 유전자로 알려진 AMPK 발현에 미치는 영향을 규명하고자 HepG2-HBx stable 세포에 Nitric oxide (NO)의 자극을 주었을 때 HBx가 발현하는 세포에서 AMPK 발현이 증가함을 western blotting 방법을 통해 확인하였음.
◦CA-AMPKα1, DN-AMPKα1 form의 발현 벡터를 제작하고 sequencing을 통해 확인하였으며 western blotting 방법을 통해 발현 능력을 검증하였음.
◦HBx가 발현하는 2가지 간암 세포주에 CA-AMPKα1, DN-AMPKα1 form의 발현 벡터를 transfection 후 selection 과정을 통해 HBx/CA-AMPKα1, HBx/DN-AMPKα1 stable 세포주를 구축하였으며, 이 세포주들을 이용하여 in vitro 상에서 세포증식 양상을 검증하였음. 그 결과, HBx/DN-AMPKα1세포주가 HBx/CA-AMPKα1세포주보다 세포증식이 활발함을 확인하였음.
◦HBx, iNOS, AMPK 유전자간에 상호작용을 규명하고 HBx/iNOS에 의한 AMPK의 조절 및 tumorigenesis에 영향을 미치는 down stream target의 발현양상을 규명하였음.
◦세포주(HBx, HBx/CA-AMPKα1, HBx/DN-AMPKα1)를 NOD/SCID mice 접종에 의한 종양 형성 능력을 검사한 결과, HBx에 의한 종양형성은 AMPK의 조절을 통해 이루어짐을 확인하였음.

Abstract ▼

3. Research Results:
① iNOS signaling plays an essential role in inducing HCC by HBx.
- iNOS deletion showed a marked decrease in the hepatic tumor size and stage of HBx transgenic (Tg) mice, indicating a strong contribution of iNOS signaling pathways to hepatocarcinogenesis.
- Nitric oxide

3. Research Results:
① iNOS signaling plays an essential role in inducing HCC by HBx.
- iNOS deletion showed a marked decrease in the hepatic tumor size and stage of HBx transgenic (Tg) mice, indicating a strong contribution of iNOS signaling pathways to hepatocarcinogenesis.
- Nitric oxide (NO) increased HBx mRNA by recruiting CREB to the CRE site of HBV enhancer in HepG2 cells, suggesting a positive feedback loop between HBx and iNOS signaling pathway.
- iNOS-modulated JNK activation was associated with sustained upregulation of Cyclin D1 in HBxTg mice and HepG2-HBx cells.
② AMPK is a target of HBx/iNOS signaling involved in HCC and metabolic disorder.
- AMPK expression was greatly decreased in tumor of HBV patients and HBx mice liver tumors.
- iNOS regulated the activity of AMPK in HBx expressing HCC cells as well as HBx tg mice.
- Cell proliferation of HBx expressing HCC cells was regulated by the expression of AMPK in HBx/CA-AMPKα1 and HBx/DN-AMPKα1 HCC cells.
- Nude mice experiment confirmed that AMPK is involved in regulation of tumorigenesis by HBx.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 1) 연구배경 및 필요성 ... 7
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 10
• ◦세포배양 ... 10
• ◦Plasmid construction ... 10
• ◦RNA 분리와 Quantitative real-time PCR 분석방법 analysis ... 10
• ◦Western blotting ... 10
• ◦Stable transfection and selection ... 11
• ◦Cell proliferation assay ... 11
• ◦Histology and Immunohiostochemisty (IHC) staining ... 11
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 12
• 1) HBx 마우스와 HBxTg/iNOS-/- 마우스 간조직의 병리학적 분석 ... 12
• 2) HBx 마우스와 HBxTg/iNOS-/- 마우스 간의 분자영상 분석 ... 14
• 3) HBx 마우스와 HBxTg/iNOS-/- 마우스 간조직에서의 암성장 관련 단백질들의 발현 검색 ... 15
• 4) HBx 마우스, HepG2-HBx 세포주, HBV 환자 간조직에서 AMPK 발현 검색 ... 17
• 5) HBx 마우스, HepG2-HBx 세포주에서 AMPK 조절에 관련된 ATP levels의 변화 검색 ... 18
• 6) AMPKα1의 dominant negative (DN), constitutively active (CA) form의 발현 벡터제작 ... 19
• 7) HepG2-HBx, AMPK double stable 세포주 제작 및 세포증식 양상 검증(MTT assay, Soft agar assay) ... 20
• 8) HBx/iNOS에 의한 AMPK 및 down stream target의 발현 양상 규명 ... 21
• 9) HBx가 발현하는 세포에서 AMPKα1의 apoptosis에의 관련성 ... 24
• 10) 세포주 (HBx, HBx/CA-AMPKα1, HBx/DN-AMPKα1)의 nude mice 접종에 의한 종양 형성능력 검색 및 분석 ... 24
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 27
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 28
• (1) 연구성과 총괄 ... 28
• (2) 연구성과 상세내역 ... 29
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 31
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 32
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 32
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 32
• 7. 참고문헌 ... 33
• 8. 첨부서류 ... 34
• 끝페이지 ... 35