보고서 정보
주관연구기관 |
연세대학교 원주산학협력단 |
연구책임자 |
정건섭
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2013-07 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
교육과학기술부 |
사업 관리 기관 |
한국연구재단 |
등록번호 |
TRKO201400006196 |
과제고유번호 |
1345176832 |
사업명 |
지역대학우수과학자지원사업 |
DB 구축일자 |
2014-05-31
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초록
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본 연구는 지렁이 장내미생물을 DGGE 분석방법 및 배양방법을 이용한 비교분석을 통하여 지렁이 장내미생물 균총을 조사하였고 이 과정에서 분리된 지렁이 장내미생물로부터 유기물 분해활성이 우수한 미생물을 발굴하여 고분자 유기물을 분해하는 효소에 관한 기초 자료를 마련하고자 수행하였다.
1년차 연구에서는 지렁이 장내미생물 조사를 위한 PCR-DGGE 최적 조건을 확립하기 위해서 지렁이 장내 우점미생물로 보고되었던 미생물의 표준균주 6종의 16S rDNA에 대한 PCR 증폭시 적합한 universal primer의 특이성과 효율성을
본 연구는 지렁이 장내미생물을 DGGE 분석방법 및 배양방법을 이용한 비교분석을 통하여 지렁이 장내미생물 균총을 조사하였고 이 과정에서 분리된 지렁이 장내미생물로부터 유기물 분해활성이 우수한 미생물을 발굴하여 고분자 유기물을 분해하는 효소에 관한 기초 자료를 마련하고자 수행하였다.
1년차 연구에서는 지렁이 장내미생물 조사를 위한 PCR-DGGE 최적 조건을 확립하기 위해서 지렁이 장내 우점미생물로 보고되었던 미생물의 표준균주 6종의 16S rDNA에 대한 PCR 증폭시 적합한 universal primer의 특이성과 효율성을 검토하였는데, 341FGC-518Rprimer가 DGGE 분석의 최적 primer 로 선정하였다. 지렁이 장내미생물을 배양방법과 비배양방법에 의해 조사한 결과, 지렁이 장으로부터 호기성 미생물 72주와 혐기성 미생물 55주를 순수분리하였고 호기성과 혐기성 조건하에서 지렁이 장내 우점미생물은 Aeromonas와 Bacillus로 확인하였다. 비배양방법인 PCR-DGGE 분석결과, 지렁이 먹이원, 장내, 분변토로부터 39개의 16S rDNA band를 분리하였으며, 미생물 동정결과 Aeromonas가 우점하는 것으로 확인하였다. 그리고 Bacillus, Clostridium, Enterobacter, Photobacterium, Pseudomonas, Shewanella, Streptomyces, uncultured chloroflexi bacterium, uncultured bacterium 등의 미생물들도 동정하였다.
2년차 연구에서는 총 2,000 주의 분리미생물을 colloidal chitin, olive oil, skim milk가 각각 기질로 함유된 screeing 액체배지에 접종하여 배양한 후, 배양상등액을 조효소액으로 사용하여 키틴분해, 지질분해, 단백질분해 효소활성을 측정하였다. 각각 기질로 함유된 screeing 액체배지와 4종류의 기질이 모두 함유된 DAVIS 액체배지에 접종하여 배양한 후, chitinic, lipolytic, proteolytic 효소 활성이 가장 높은 미생물 GA9, PL43, EF16을 각각 최종선발하였다. 16S rDNA 분석을 통해 키틴분해 효소활성이 가장 높은 GA9는 Bacillus licheniformis, 지질분해 효소활성이 가장 높은 PL43은 Aeromonas hydrophila, 단백질 분해효소활성이 가장 높은 EF16은 Bacillus subtilis로 미생물 동정하였다.
3년차 연구에서는 키틴분해 활성이 가장 우수한 B. licheniformis GA9의 배양상등액을 40-60% 황산암모늄 침전 농축, 이온교환 및 겔 크로마토그래피 방법으로 정제한 결과, 분자량은 52.1 kDa, 최적pH와 최적 온도는 pH 5.0, 40℃로 나타났고, pH 5.0-6.0와 20-50℃ 온도에서 안정하였으며, 금속이온인 Co2+ , Mn2+에 의해 활성이 증가하였으며, Fe2+에 의해서는 활성이 억제되었다. 아미노산 서열분석결과, DSGKNGKIIRYYPIR로 확인되었다. 지질분해 활성이 가장 우수한 A. hydrophila PL43의 배양상등액을 35-45% 황산암모늄 침전 농축, 이온교환 및 겔 크로마토그래피 방법으로 정제한 결과, 분자량은 74 kDa, pNPB를 기질로 사용했을 때 최적 pH와 온도는 pH 8.0와 50℃로 나타났고, pNPP 를 기질로 사용했을 때 최적 pH와 온도는 pH 8.0와 60℃로 확인하였다. pH 7.0-10.0와 20-60℃ 온도에서 안정하였으며, 금속이온인 Co2+,Cu2+, Fe2+에 의해 활성이 억제되었으며, K m 값과 Vmax 값은 pNPB 기질에서 1.07 mM과 7.27 mM/min이었고, pNPP 기질에서 1.43 mM와 2.72 mM/min이었다.
단백질 분해 활성이 가장 우수한 B. subtilis EF16의 배양 상등액을 40-80% 황산암모늄침전 농축, 이온교환 및 겔 크로마토그래피 방법으로 정제한 결과, 분자량 22.8 kDa와 19.5 kDa에 두 종류의 단백질로 확인되었다. 아미노산 서열 분석 결과, AQGVPYGVSQIKAPA와 HMVPMVRNPFIKKRS로 분석되었다.
정제한 효소는 pH 10.0과 40℃에서 활성이 가장 높았고, pH 8.0-10.0과 20-50℃ 온도에서 효소가 안정하였다. 또한 금속이온인 Ca2+, Co2+, Mn2+, Zn2+을 첨가하였을때 단백질 분해활성이 증가한 반면, PMSF에 의해 효소활성이 90% 이상 저해되었다. 이러한 결과는 B. subtilis EF16으로부터 정제된 효소가 세린계열에 속하는 알칼리성 프로테아제로 추정되었다.
목차 Contents
- 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
- 목 차 ... 2
- Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
- Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
- 1. 연구과제의 개요 ... 4
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
- 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 5
- 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 7
- 5. 연구결과의 활용계획 ... 7
- Ⅲ. 연구성과 ... 8
- 끝페이지 ... 11
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