바이러스 벡터의 개발을 위해서는 감염성 클론의 구축이 선행되어야 하므로, T7 promoter-driven CFMMV 클론을 구축하였으며, 이 과정에서 병징을 보이지 않는 SA(symptom atttenuation) 클론을 선발할 수 있었다. SA clone의 경우 병징이 거의 관찰되지 않았으며, N. benthamiana와 오이, 멜론 등에서 PCR, GDD, Western blot에서 바이러스의 외피단백질이 정상 발현되고 있음을 확인하였고, 과실에서의 RT-PCR과 Fruit tissue printing을 통하여 과실에서도 바이
바이러스 벡터의 개발을 위해서는 감염성 클론의 구축이 선행되어야 하므로, T7 promoter-driven CFMMV 클론을 구축하였으며, 이 과정에서 병징을 보이지 않는 SA(symptom atttenuation) 클론을 선발할 수 있었다. SA clone의 경우 병징이 거의 관찰되지 않았으며, N. benthamiana와 오이, 멜론 등에서 PCR, GDD, Western blot에서 바이러스의 외피단백질이 정상 발현되고 있음을 확인하였고, 과실에서의 RT-PCR과 Fruit tissue printing을 통하여 과실에서도 바이러스가 증식하고 있음을 보여주었다. SA 클론의 전장 염기서열 분석을 수행하여 CFMMV-Is RdRp 내의 799aa의 leucine(L)이 proline(P), 876aa인 glutamate(E)가 glycine(G)으로, 1139aa인 valine(V)의 glycine(G)으로의 변이가 발견되었는데 아미노산 하나의 변이만을 유발한 클론 접종 결과 첫 번째 아미노산인 leucine(L)에서 proline(P)의 변이가 바이러스의 증식을 크게 억제시키며 이로 인하여 병징발현이 이루어지지 않는 결과가 나타났다. 그 외에도 미세한 병징을 유발하는 클론을 선발할 수 있었는데 이는 1135aa Tyrosine에서 Histidine으로의 변이와 1139aa인 valine(V)을 glycine(G)의 변이가 동시에 일어났을 때 병징의 발현속도가 늦고 약한 병징을 보이는 것으로 확인되었다. 이에따라 변이가 심한 RdRp의 약 3500bp를 교체하여 전형적인 병징을 나타내는 클론을 얻었다. 이후 시간과 비용이 많이 소요되는 T7 promoter-driven clone의 문제점을 해결하고자 CaMV 35S promoter를 포함하는 CFMMV 클론을 만들었으며, 유전자를 삽입할 수 있는 MCS가 포함된 벡터를 제작하고자 하였다. 벡터를 만들 때 외피 단백질의 subgenomic promoter의 범위를 파악하는 것이 선행되어하므로 deletion mutant를 만들어 그 범위를 파악하였다. 외피단백질의 시작코돈 뒷부분의 promoter 범위를 +27, +37, +55, +68, +88, +100, +127, +140, +160으로 예측하여 그 뒤에 EGFP가 삽입된 deletion mutant를 각각 제작하였고N. benthamiana에 접종하였을 때 +100bp에서 발현량이 최대임을 확인하였다. 시작코돈 앞부분의 범위를 확인하기 위하여 MP deletion mutant를 제작하였고, 이 또한 -30, -55,-81, -93, -100, -110, -121, -127, -148, -157, -170, -187, -204bp를포함하게제작하여접종하여SDS-PAGE를통하여 단백질을 확인하였을 때, -30bp를 제외한 그 이후 모든 클론에서 외피단백질의 발현이 이루어짐을 관찰하였고 -55~-100bp까지는 상위엽에서 병징이 나타나지 않았으나, -110bp~204bp 에서는 CFMMV 병징이 발현되었다. 이는 외피단백질의 발현량이 long-distance movement 가 가능할 만큼 충분히 발현되기 때문일 것으로 사료되어진다. 이 결과를 참고하여 35S CFMMV 벡터를 구축하였는데 가장 EGFP의 발현이 높게 나타난 것은 -93bp를 promoter 범위로 갖고 있는 벡터 접종 식물에서 였는데 이는 실제 activity가 가장 높은 promoter의 범위와 바이러스 벡터로서 효율적으로 외래 단백질의 발현을 야기할 수 있는 범위는 다르다는 것을 시사하였다. 또한 외래단백질의 발현량을 높이기 위한 시도로 외래단백질과 외피단백질사이에 3'NTR을 추가적으로 삽입한 벡터와 외래단백질과 외피단백질의 위치를 바꾸어준 벡터를 구축하였고, CFMMV의 게놈을 두 개의 분절게놈으로 인위적으로 나누어 준 벡터들을 적용하였으나, 이들 모두 앞서 구축한 벡터 이상의 효율을 보여주지는 못하였다. 하지만 의미 있는 것은 하나의 게놈을 갖고 있는 바이러스를 두개의 분절게놈으로 나누어 주어 식물에서 증식이 정상적으로 일어난 결과는 본 연구에서 처음 얻을 수 있었다. 또한 homologous recombination 현상의 문제를 해결해 주기 위해 KGMMV, CGMMV, RMV, TMGMV 와 같은 tobamovirus group내 타 바이러스와의 재조합 벡터도 구축하였으나 높은 효율을 보이지는 못하였다. 하지만 효율을 높일 수 있도록 p19 suppressor와 함께 접종하였을 때 접종엽에서 상당한 발현율의 증가를 관찰 할 수 있었다. 여기까지의 결과를 바탕으로 개발된 시스템에 chicken interleukin15을 삽입하여 수박에서 발현하는데 성공하였다. VIGS를 수행하기 위하여 pds 유전자를 reporter로 실험한 결과, N. benthamiana와 melon에서 특히 효율적인 gene silencing을 관찰 하였고, 멜론의 과실 또한 gene silencing이 일어난 것을 확인 하였다. 수박에서의 VIGS 시스템을 이용한 내재유전자 발현억제의 구현 가능성을 보기 위하여 eIF4E를 CFMMV-vector로 발현 억제 시킨 후 ZYMV를 감염시켰을 때, 그 감염성이 억제되어 저항성 획득이 가능한 결과를 얻을 수 있었다.
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