초록 ▼

퇴행성 신경질환의 진행과정에 있어 비정상적으로 형성된 단백질응집체가 정상적으로 제거되지 않으면 특정영역 신경세포들의 사멸이 유도됨. 본 연구에서는 단백질응집체 형성에 관여되고 있는 다양한 protein modification중 sumoylation과 관련된 단백질들의 가역적 조절 인자인 SENP1의 퇴행성 뇌질환에서의 기능 규명에 목표를 두고 있음. 퇴행성 신경질환에서 SENP1의 기능이 기대되어지는 이유는, 첫째, 선행연구 결과상에서 SENP1이 랫드의 substantia nigria의 도파민산생 뉴런 세포에서 강하게 발현되는 것

퇴행성 신경질환의 진행과정에 있어 비정상적으로 형성된 단백질응집체가 정상적으로 제거되지 않으면 특정영역 신경세포들의 사멸이 유도됨. 본 연구에서는 단백질응집체 형성에 관여되고 있는 다양한 protein modification중 sumoylation과 관련된 단백질들의 가역적 조절 인자인 SENP1의 퇴행성 뇌질환에서의 기능 규명에 목표를 두고 있음. 퇴행성 신경질환에서 SENP1의 기능이 기대되어지는 이유는, 첫째, 선행연구 결과상에서 SENP1이 랫드의 substantia nigria의 도파민산생 뉴런 세포에서 강하게 발현되는 것이 확인됨. 둘째, SENP1이 ER stress상태에서 세포 내에 protein aggregation을 이루고 퇴행성 뇌질환 원인 단백질들(parkin1, DJ1, Tau1, Presenalin, α-synuclein)과 결합을 이룸. 세째, 단백질응집체에서의 SUMO-타켓 단백질들을 조절할 수 있다는 가능성과 네째, SENP1이 ubiquitination관련 pathway에도 작용을 한다는점, 다섯째, 최근 redox 상태에서 SENP1에 대한 기능적 역할들이 보고됨에 따라 SENP1의 퇴행성 뇌질환에서의 기능 규명에 목표를 두고 진행하였음.
첫째, SENP1이 뇌조직에서 정상적으로 발현되어지는 가를 분석하기 위해 랫드 뇌의 다양한 부위를 이용하여 RT-PCR 및 면역조직화학적으로 분석한 결과, 대뇌흑질(SN), 대뇌피질(CR), 해마(HC), 소뇌(CTX), 뇌선조체(ST)의 순으로 발현빈도가 높게 나왔으며 면역조직화학적 염색상에서도 SENP1이 대뇌흑질(SN)에서 발현이 강하게 나타났음. 둘째, Cos7 세포내에서 SENP1 wild-type과 deletion construct의 subcellular localization을 알아본 결과, WT와 △N-teminal은 세포질내에 발현을 나타내었고 △C-teminal 과 enzyme mutant form(C603S)은 핵에서 발현을 나타내었음. 따라서 C-terminal에 nuclear export signal(NES)을 가지고 있음을 알 수 있음. 신경독성 및 ER stress유발물질인 MG132를 Cos7세포에 처리했을 시 단백질응집체가 형성됨을 알 수 있음. 또한 NES signal이 단백질응집체형성에 중요함을 알 수 있음. 셋째, GFP-SENP1에 MG132를 처리한 후 다양한 퇴행성 뇌질환 단백질응집체 마커들과 double staining상에서도 이들과 함께 분포하는 것을 알 수 있음. 따라서, SENP1이 다양한 퇴행성 뇌질환 단백질들과 결합하는지를 알아본 결과 흥미롭게 대부분의 타겟단백질들과 결합하는 것을 알 수 있음. 넷째, 각각의 퇴행성 뇌질환 단백질들과의 기능적 상관관계를 알아본 결과, SENP1과 Tau1의 cotransfection상에서 SENP1단백질이 Tau1단백질의 microtubule과 함께 발현되는 것이 관찰되었음. 또한 시간이 지나감에 따라 microtubule의 구조가 와해되어지는 것을 관찰할 수 있었음. 이는 SENP1이 Tau1단백질의 안정성을
조절할 것으로 예상하여 western blot한 결과 SENP1과 Tau1을 같이 발현시키면 Tau1단독보다 단백질발현이 줄어든 것을 알 수 있음. 또한 ubiquitination실험을 한 결과 SENP1에 의해 Tau1이 degradation이 되는 것을 확인하였음. 추가적으로 Tau1의 microtubule이 SENP1의 과발현에 의해 acetylation이 감소되어지는 것을 알 수 있었음. Tau1은 SENP1에 의해 ubiquitin-dependent한 acetylation이 억제되는 것을 알 수 있음. 다섯째, SENP1은 Parkin1과 DJ-1(Parkin7)과 colocalization을 이루는 것을 알 수 있었음. 또한 DJ-1 mutant form L166P과 SENP1을 cotransfection한 상태에서 H2O2, MPP+, No donor(SNAP)를 처리시 DJ-1 wild-type과는 달리 DJ-1 L166P의 발현양상에 SENP1이 관여함을 알 수 있었음.
In vivo 퇴행성 뇌질환모델에서 SENP1의 발현양상을 알아보기위해 랫드 뇌허혈성 모델에서의 SENP1의 발현양상을 면역조직화학적 및 Western blot을 사용하여 알아본 결과 시간경과별(1시간30분, 3일) 뇌허혈성 손상이 증가된 곳에서 SENP1이 강한 발현양상을 나타내었음. 뇌의 redox상태에서 SENP1이 증가됨을 알 수 있음. 대뇌흑질부위에 LPS를 투여한 퇴행성 뇌염증모델에서도 SENP1이 강하게 발현됨을 알 수 있음. 단백질응집체가 형성되어지는 퇴행성 뇌질환 동물모델을 유도하기 위해 MG132를 대뇌흑질부위에 투여한 후 1일과 3일 경과한 후 SENP1을 염색한 결과 단백질응집체가 형성된 손상세포에서 특이적으로 강하게 발현된 것을 알 수 있었음.
종합적으로 SENP1이 in vitro 및 in vivo 모델에서 비정상적인 단백질응집체 형성에 관여함을 알 수 있었고 다양한 퇴행성 뇌질환 타겟단백질들과도 뇌질환 특이적 기능을 가지는 것이 확인되었음. 따라서 SENP1의 기능을 직간접적으로 조절하는 유전자치료제 및 신약개발을 통하여 향후 임상적 적용에 응용되기를 바라는 바임.

목차 Contents

• 일반연구자지원사업 최종(결과)보고서 ... 1
• 목 차 ... 3
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 4
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 5
• 1. 연구과제의 개요 ... 5
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 7
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 11
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 15
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 15
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 16
• Ⅲ. 연구성과 ... 17
• 끝페이지 ... 17