초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
□ 제1세부과제 : 대사체학을 이용한 음파 처리 후 식물병 방제기작 규명 및 실용화
1. 다양한 음파 (250, 500, 1000, 2000, 3000hz 80db, 1시간 처리)를 애기장대 식물에 처리한 결과 전체 지방산 함량 및 조성의 변화를 프로화일링 할 수 있었고, 총 여섯 가지의 지방산을 측정하였고, 5가지의 음파처리 모두 3개의 [Hexadecanoic acid (16:0), Hexadecenoic acid (16:1), Octadecadienoic acid (18:2)] 지방산 양에서 감소됨

Ⅳ. 연구개발결과
□ 제1세부과제 : 대사체학을 이용한 음파 처리 후 식물병 방제기작 규명 및 실용화
1. 다양한 음파 (250, 500, 1000, 2000, 3000hz 80db, 1시간 처리)를 애기장대 식물에 처리한 결과 전체 지방산 함량 및 조성의 변화를 프로화일링 할 수 있었고, 총 여섯 가지의 지방산을 측정하였고, 5가지의 음파처리 모두 3개의 [Hexadecanoic acid (16:0), Hexadecenoic acid (16:1), Octadecadienoic acid (18:2)] 지방산 양에서 감소됨을 확인 할 수 있었다. 특히 hexadecenoic acid는 5가지의 음파처리 모두에서 확연히 감소된 양을 보여주었다. 또한 trienoic aicds는 1000Hz에서 다른 음파에 비해 확연히 감소됨을 알 수 있었다.
2. 최적의 저항성은 최종적으로 1000Hz, 100db 10일동안 매일 3시간 처리 조건에서 나타났으며, CE-TOFMS기법을 이용하여 애기장대 잎으로부터 160여종의 대사체를 추출하여 비교 분석할 수 있었다. 그 중 생물체에서 가장 중요한 에너지 대사과정인 Glycolysis과정과 TCA (tricarboxylic acid) cycle에서 거의 모든 대사체들이 병원균 감염 48시간 후 감소된 경향을 나타내었다. 비슷한 경향은 ATP 생합성 경로에서도 관찰되었다. 또한 대부분의 아미노산 역시 감소한 경향을 나타내었다. ATP합성의 기초되는 물질인 adenine과 adenosine은 많은 양이 축적되었고, Urea cycle에서 glutamate와 histidine, GA BA (gamma-aminobutyric acid)와 같은 대사체들이 감소하였다. 그에 반해 glutathione은 식물에서 중요한 산화적 스트레스 반응물질인데 대조군에 비해 증가하였다. Nicotinamide 또한 증가한 모습을 보였다. 음파처리가 식물의 생장에 부정적인 영향이 있는지를 확인하기 위해서 건중량 측정을 통해서 음파의 식물 생장에의 영향을 알아 보았는데 그 결과, 잎과 줄기의 건중량 에서는 1000Hz, 2000Hz, 3000Hz 처리 식물이 확연히 증가 되었고, silique(종자포함조직) 건중량 에서는 2000Hz 처리 식물이 확연히 증가된 양를 보여주었다. 또한 뿌리를 제외한 총 건중량이 1000Hz를 처리했을 때 가장 큰 증가(25%)를 보여주었다. Primary/secondary stem 숫자의 경우 1000Hz 처리에서 가장 높은 stem 숫자를 보였다.
□ 제2세부과제 : 오믹스 (omics) 기법을 이용, 음파처리 후 생성된 식물병 저항 물질의 지문분석 및 실용화
1. 1000 Hz 음파를 식물체에 처리한 후, 식물병원균인 B otryis cinerea를 처리한 후 반응 시간별 애기장대 단백질 2-DE를 수행한 결과, 음파를 처리하지 않은 처리구와 비교하여 총 70개 단백질 spot의 발현정도가 음파처리와 함께 병원균을 처리했을 때 의미 있는 차이를 보였다.
2. 유전자를 이용하여 gene의 발현을 검정한 결과, 특정음파 1000Hz가 처리된 애기장대에 식물병원균을 접종한 후, 시간별(24, 48, 96시간)에서 음파가 처리되지 않은 대조군에 비해 gene의 발현이 증가 되는 것을 확인 할 수 있었다.
3. A PX , DHAR, GR, SOD의 활성은 음파와 병원균을 동시에 처리했을 때 각 효소의 활성이 병원균 처리 후, 반응 시간에 따라 증가 하는 것을 확인 하였고 반면, CAT활성은 음파 처리에 따라 효소활성에 유의적인 변화를 보이지 않았다.
4. 각 파장별 음파 처리 후 시간별 애기장대의 단백체를 분석하였을 때 하각 음파 영역에서 발현되는 단백질들은 음파의 파장 영역이 높아질수록 음파에 의해 발현되는 단백질들이 더 증가하는 패턴을 확인하였고, 그중에서 1000 Hz 와 3000 Hz의 음파 영역을 처리 하였을 때 증가되는 단백질의 수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다
5. 1000Hz 음파가 처리된 애기장대에 식물병원균을 처리한 후, 대표적인 6가지 식물호르몬 Cytokinin, GA 3(gibberellin), IA A(indole-3-acetic acid), SA (salicylic acid), JA(jasmonate), A BA (abscisic acid)을 LC/Mass(Liquid Chromatography-Mass spec.)를 이용하여 분석한 결과, 양적으로 SA의 경우 가장 특이적으로 음파 처리한 군에서 병원균 처리 후 계속 높은 양을 보여주고 있고 이에 반해 JA의 경우는 대조군에 비해 감소한 경향을 나타내었으며, ABA 호르몬 함량이 음파 처리 후, 병원균을 처리한 96시간 이후에 대조구와 비교 하였을 때 급격히 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, Cytokinin, GA3의 함량은 LOD 이하로써 확인 할 수 없었다.
6. B otryis cinerea 접종 후 72 시간이 경과 하였을 때 애기장대의 폴리페놀 화합물을 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과 250, 280 nm 검출파장에서 16개의 주요한 대사체피크가 확인 되었다. 동정된 화합물은 adenosine (2), indolic 유도체 (1, 3, 4, 6, 11, 13), kaempferol 유도체 (7, 8, 10), tryptophan (5), sinapic acid (9), 4-methylsulphinylbutyl Isothiocyanate (ITC) (12), p-coumaroylagmatine 유도체 (14, 15, 16)인 것으로 확인 되었다.
7. 파장별 (250, 500, 1000, 2000, 3000 Hz) 음파처리가 애기장대의 대사체에 미치는 영향을 살펴본 결과 동정된 11개의화합물 중 3번 (Kaempferol 3-O-rhamnosyl glucoside 7-O-rhamnoside), 4번 (Kaempferol 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside) 그리고 6번 (Kaempferol 3-O-rhamnoside 7-O-rhamnoside) 화합물은 의미 있는 변화를 나타내었다.
□ 제3세부과제 : 음파처리를 통한 식물병 저항성 유전자 및 항균물질 유도생성 및 이를 이용한 식물병방제
1. 각기 서로 다른 음파를 처리 하였을 시 500Hz의 음파를 처리한 결과가 다른 음파처리군과 가장 많은 유전자를 공유하고 있다. 이는 단 기간 처리에서는 500Hz가 가장 많은 유전자 반응을 유도했음을 보여준다. 증가한 유전자 중 5종류의 음파에 공통적으로 발현된 유전자는 총 4개(At5g22380, A t1g76650, At4g17500, At1g33760)로 밝혀졌다. 이외에도 다양한 조건에서 처리한 결과 500Hz 가 sound-inducible gene을 선발 하는데 가장 적합하였고 이를 바탕으로 여러 개의 후보유전자를 선발하였다.
2. 최종적으로 아래의 음파처리조건에서 최적의 병저항성이 유도 되었다 ; 1000Hz, 100dB (decibel), 하루에 3 시간씩 10일간 음파처리, 병원균처리 (10일째 음파처리 후 잿빛곰팡이를 (Botrytis cinerea) 5 x 10⁵ spores/mL 농도로 음파가 처리된 식물에 스프레이를 이용하여 3번에 걸쳐 뿌려 접종).
3. 최적의 병저항성이 유도된 애기장대 식물에서 반응한 유전자의 수는 병원균 접종 후 시간이 지날수록 반응하는 유전자의 수가 많아짐을 확인하였고, 각 시간별로 반응한 유전자를 보았을 때, 병원균 접종 후 0시간 즉, 음파를 처리하기 바로 전 상태에서는 8개의 증가된 유전자, 14개의 감소된 유전자들이 있었다. 접종 후 12시간째에는 35개의 증가한 유전자와 34개의 감소한 유전자들이 확인되었다. 접종 후 24시간째에는 93개의 증가된 유전자와 113개의 감소된 유전자가 있었다. 또한 microarray의 결과를 검증한 결과 대부분의 QPCR 결과는 microarray 결과와 일치하였다.
4. Microarray 결과를 통해 병저항성 증진 유전자들이 식물호르몬 Jasmonic acid(JA )와 Salicylic acid(SA) 관련 되었다는 것을 확인 하였으며, 각 호르몬의 수치 또한 병감염 동안 증진됨을 확인할 수 있었다. SA 관련된 병저항성 증진 유전자들이 병 감염 동안 이른시기에 증가함을 확인 하였고, 대조적으로 JA 생합성 유전자의 경우 상대적으로 감소 혹은 억제된 경향을 나타내었다.

Abstract ▼

Ⅲ. Results
1. Through treatment of various frequencies (250, 500, 1000, 2000, 3000 hz 80db, 1hour), we did profiling contents and component of entire fatty acid, and total 6 fatty acids were detected, and in all treatments, these 3 fatty acids [Hexadecanoic acid (16:0), Hexadecenoic acid (16:1),

Ⅲ. Results
1. Through treatment of various frequencies (250, 500, 1000, 2000, 3000 hz 80db, 1hour), we did profiling contents and component of entire fatty acid, and total 6 fatty acids were detected, and in all treatments, these 3 fatty acids [Hexadecanoic acid (16:0), Hexadecenoic acid (16:1), Octadecadienoic acid (18:2)] were decreased. Especially, hexadecenoic acid showed significant declination. Treinoic acids were highly reduced in 1000hz-treated-plants.
2. We finally established optimal condition for induced resistance as we described below ; 1000 Hz, 100db, daily 3 hours for 10days treatment. Using CE-TOFMS, 160 different types of metabolite were studied in Arabidopsis rosette. Among them, the metabolites involved in glycolysis and TCA cycle which have crucial role in energy metabolism were highly decreased inoculation after 48 hours. ATP synthesis pathway showed similar pattern as glycolysis and TCA cycle did. In addition, amount of most amino acids was less accumulated in sound-treated plants. In urea cycle, glutamate, histidine, and GABA were reduced. On the other hand, nicotinamide was increased in sound-treated plants.
3. In measurement of dry weight of sound-treated plants under condition (250, 500, 1000, 2000, 3000Hz, 80db daily 1hour for 14days treatment), leaves and stem dry weight were significantly increased in three types of treatment (1000, 2000, 3000Hz), silique dry weight was highest in 2000Hz treatment group.
4. In analysis of proteome induced by 1000hz treatment during infection, total 70 protein spots were changed significantly. Correlation between those protein spots and their genes was analyzed, and their genes showed similar pattern.
5. Activity of antioxidant enzyme including APX, DHAR, GR, SOD was tested in 1000Hz treated plants during infection. They were gradually increased during pathogen infection. However, CAT enzyme did not show any changes during infection.
6. In five different frequencies treatments, 1000Hz, 3000Hz showed higher number of protein induced. In this experiment, the higher frequency we treat, the higher number of genes induced in plants.
7. As a consequence of analysis of 6 different type of phytohormone, amount of SA was significantly increased during infection. In contrast, amount of JA were less accumulated in sound-treated plants. In case of ABA, it was increased after 96 hour infection, and Cytokinin and GA3 were not detected because of low LOD.
8. 72 hour after Botrytis inoculation, 16 major polyphenol compounds were detected at 250 nm and 280 nm. Identified compounds were adenosine (2), indolic derivatives (1, 3, 4, 6, 11, 13), kaempferol derivatives (7, 8, 10), tryptophan (5), sinapic acid (9), 4-methylsulphinylbutyl Isothiocyanate (ITC) (12), p-coumaroylagmatine derivatives (14, 15, 16).
9. In five different frequencies treatments, among identified 11 compound, No 3 (Kaempferol 3-O-rhamnosyl glucoside 7-O-rhamnoside), No 4 (Kaempferol 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside), and No 6 (Kaempferol 3-O-rhamnoside 7-O-rhamnoside) showed significant changes.
10. In five different frequencies treatments, 500 Hz-treated- plants showed highest number of induced genes and included highest number of common genes with other frequencies. All common genes were At5g22380, At1g76650, At4g17500, and At1g33760. Through various experiment, we conclude optimal frequency for finding sound-inducible genes and selected candidate genes from 500 Hz treatment.
11. We finally established optimal condition for induced resistance as we described below ; 1000 Hz, 100db, daily 3 hours for 10days treatment, and then spaying Botrytis spore suspension 5 x 10⁵ spores/mL three times.
12. In 1000Hz treated plants, number of sound-inducible genes was gradually increased during Botrytis infection. At oh, 8 increased genes and 14 reduced genes were. 12 hour after inoculation, 35 genes were up-regulated, 34 genes were down-regulated. 24 hour after inoculation 93 genes were induced, and 113 genes were declined. These results were confirmed by Real-time PCR.
13. The genes detected by microarray were associated with disease resistance. Most were related to SA mediated response. Those were induced early during infection (12, 24 after inoculation). On the other hand, JA mediated genes were not detected in microarray or down-regulated.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• CONTENTS ... 12
• 목차 ... 14
• 제 1 장 서 론 ... 16
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 16
• 제 2 절 연구개발의 범위 ... 16
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 18
• 제 1 절 국·내외 관련분야에 대한 기술개발현황 ... 18
• 제 2 절 연구결과가 국·내외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 19
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
• 제 1 절 최적의 병저항성 유도 음파처리방법 탐색 및 잿빛곰팡이 병원균 (Botrytis cinerea) 처리/병 발생분석 방법 확립 ... 20
• 제 2 절 병저항성 유전자/항균물질 생성 최적음파 탐색 및 병저항성 관련 유전자 발굴과 항균물질 탐색 ... 26
• 제 3 절 음파를 처리한 식물과 처리하지 않은 식물에 병원균을 접종한 후 애기장대 잎에서 대사체를 추출하여 대사체 프로화일링 ... 42
• 제 4 절 애기장대에 각 영역의 음파처리(250, 500, 1000, 2000, 3000Hz) 및 최적(1000Hz) 음파처리에 의한 식물병원균(B otrytis cenerea) 접종 후, 단백질 profiling을 이용하여 병 저항성과의 상관관계 분석 ... 48
• 제 5 절 애기장대에 최적 음파(1000Hz)처리에 의한 식물병원균(Botrytis cenerea) 접종 후, 반응시간에 따른 병 저항성 관련 식물호르몬 분석 및 평가 ... 70
• 제 6 절 애기장대의 음파처리에 의한 병저항성 유도물질 (elicitor)의 동정 및 음파처리 및 병원균 접종을 통한 Pathogen 유도저항성 (induced resistance) 확인 및 검증 ... 75
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 96
• 제 1 절 목표대비 달성도 ... 96
• 제 2 절 : 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타) ... 97
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 98
• 제 6 장 기타 중요 변동사항 ... 99
• 제 7 장 참고문헌 ... 100
• 끝페이지 ... 103