보고서 정보
주관연구기관 |
중앙대학교 Chung Ang University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2014-03 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201400011407 |
과제고유번호 |
1395031332 |
사업명 |
FTA대응경쟁력향상기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-06-28
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201400011407 |
초록
▼
Ⅳ. 연구개발결과
1. 체외 수태성 예측기술 (SPA )을 이용한 수퇘지 수태능력 진단
- 44두 수퇘지 정자에서 SPA를 시행한 후 산출된 SFI를 이용하여 SPA의 수태성 진단 정확성을 계산하였다. 산자수 8마리 이하를 진단하기 위하여 SFI를 1.2로 cut-off 하였을 경우 산자수 8마리 이하를 예측하는 확률은 95.45%의 정확성을 보였다. 또한 산자수 10두 이상의 씨수퇘지를 예측하기 위하여 cut-off를 2.5로 하였을 때 산자수 10 두 이상을 예측하는 확률은 93.18%의 정확성을 보였다.
2.
Ⅳ. 연구개발결과
1. 체외 수태성 예측기술 (SPA )을 이용한 수퇘지 수태능력 진단
- 44두 수퇘지 정자에서 SPA를 시행한 후 산출된 SFI를 이용하여 SPA의 수태성 진단 정확성을 계산하였다. 산자수 8마리 이하를 진단하기 위하여 SFI를 1.2로 cut-off 하였을 경우 산자수 8마리 이하를 예측하는 확률은 95.45%의 정확성을 보였다. 또한 산자수 10두 이상의 씨수퇘지를 예측하기 위하여 cut-off를 2.5로 하였을 때 산자수 10 두 이상을 예측하는 확률은 93.18%의 정확성을 보였다.
2. 고수태성 및 저수태성 씨수퇘지 정액 샘플 확보 및 번식성적 확보
- 수퇘지의 산자수 생산능력에 관여하는 번식능력관련 마커를 개발하고 이를 이용하여 객관적으로 수퇘지의 수태능력을 진단하는 측정하는 것이 본 과제의 최종 목표이다. 이를 위하여 고수태성 및 저수태성 씨수퇘지 정자에서 수정능획득 전후의 샘플을 확보하였다. 신선하게 제조된 희석정액을 당일 수집하여 PBS로 3번 세척 후 -80℃에 냉동보존 하였다.
3. 수태능력에 따라 수정능력 획득 전후의 정자 확보
- 수태능력에 따른 수정능획득관련 단백질 마커를 획득하고자, 고수태성 및 저수태성 씨수퇘지 정자를 10 ug/ml heparin이 첨가된 배양액에서 30분간 처리 하여 수정능획득을 유도하였다. 그 후 PBS로 3번 세척 후 정자를 -80℃ 냉동보존 하였다.
4. 번식 성적 데이터와 운동성(% ) 및 운동역학 비교
- 총 36개체의 수정능력획득 전후의 운동성 및 운동역학은 CASA를 이용하여 측정하였으며 번식성적(산자수)와의 상관관계를 분석한 결과 운동성과 운동역학 변수 간의 상호관계는 확인을 할 수 있었으나 산자수와의 상호관계는 없는 것으로 나타났다.
5. 번식 성적 데이터와 수정능획득 양상과의 비교
- CTC 염색법을 이용한 33개체의 수정능력획득 전후의 첨체막 검사 결과와 번식성적(산자수)을 이용하여 상관관계를 분석한 결과 수정능력획득 후 AR패턴과 산자수는 유의적인 양의 상관관계가 있는 것을 확인하였다. 또한 수정능력획득 전과 후의 F패턴은 유의적인 음의 상관관계가 있는 것을 확인하였다 (P < 0.05).
6. 수퇘지와 암퇘지의 산자수 기여도 조사
- 수퇘지가 산자수에 미치는 영향 및 암퇘지가 산자수에 미치는 영향을 알아보기 위해 이들 간의 Coefficient variation (CV)을 구하여 서로간의 차이를 비교 분석한 결과 수컷 암컷 모두 산자수에 영향을 미치는 것으로 확인 되었으며 특히 듀록 종에서 편차가 크게 나타나는 것을 확인 하였다.
7. 수정능력 획득 전후의 단백질 발현도 분석
- 2D electrophoresis 기법을 이용하여 수정능력 획득 전후의 단백질 발현도 분석결과 180개의 단백질 spot중 20개의 spot이 수정능력 획득 유무에 따라 3배 이상 발현 차이가 나는 것을 확인 하였다. 특히 15개의 단백질은 수정능력 획득 후 발현이 세배이상 감소하였으며 나머지 5개의 단백질은 수정능력 획득 후 발현도가 세배 이상 증가함을 보였다. 이들 단백질들은 Signaling pathway 9.0 프로그램을 통해 단백질들이 관여하는 특정 pathway를 확인하였다. MnSOD와 PHGPx는 ROS metabolism과 유의적으로 연관되어있으며, PHGPx와 PRDX5는 Glutathione metabolism과 유의적으로 연관되어 있음을 확인 하였다. APOA1, SDHB, ECH, TPI는 Adipocytokine signaling과 Insulin action과 유의적으로 연관되어 있으며 CAPZB, TUBB4, APOA1, ECH, TPI는 Notch pathway와 유의적으로 연관이 있었다. 또한 CAPZB는 Actin cytoskeleton assembly에 유의적으로 연관이 있음을 확인하였다.
8. 수태능력에 따른 수정능력 전후의 단백질 발현도 분석
- 수태능력에 따른 수정능력 획득 전후의 단백질 발현정도를 2D-electrophoresis를 이용하여 분석한 결과 16개의 단백질들이 3배 이상 발현차이를 보임임을 확인하였다. 이들 단백질들은 Signaling pathway 9.0 프로그램을 통해 단백질들이 관여하는 특정 pathway를 확인하였다. SDHB, ECH, TPI, AK1은 Adipocytokine signaling과 유의적으로 연관되어 있으며, TUBB4, ECH, TPI, AK1, CCT2는 Notch pathway와 유의적으로 연관되어 있음을 확인하였다. SDHB, ECH, TPI, AK1은 Insulin action과 유의적으로 연관되어 있음을 확인하였다. 또한 TPI, AK1 은 Mannose metabolism, SDHB와 NDUFS3는 Respiratory chain and oxidative phosphorylation과 연관되어 있음을 확인 하였으며, PSMB7은 Presentation of endogenous peptide antigen과 Ubiquitin-dependent protein degradation과 유의적으로 연관되어 있음을 확인하였다.
9. 단백질 마커를 이용한 산자수 예측 및 인공수정 후 산자수와의 상관관계 분석
- 무작위로 선발된 20개체의 종돈에서의 두 가지 단백질 (SDHB, ECH)의 발현도를 조사하여 인공수정후 산자수와 비교하여 분석한 결과 SDHB의 발현도는 산자수와 양의 상관관계를 나타냈으며 ECH의 발현도는 산자수와 음의 상관관계를 나타내었다. 20두 수퇘지 정자에서 ELISA를 이용하여 SDHB와 ECH의 발현도의 수태성 진단 정확성을 계산하였다. 산자수 11마리 이상을 진단하기 위하여 SDHB발현도와 ECH발현도를 각 각 3170000, 4790000으로 cut-off 하였을 경우 산자수 11마리 이하를 예측하는 확률은 각각 70%와 75%의 정확성을 보였다. 또한 산자수 12두 이상의 씨수퇘지를 예측하기 위하여 cut-off를 각각 3370000, 4790000으로 하였을 때 산자수 12두 이상을 예측하는 확률은 80%와 75%의 정확성을 보였다.
Abstract
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The prediction of sperm fertility is paramount importance for breeding animals. Howerer, none of many parameters addresses sperm function and their value in predicting fertility is questionable. Therefore, development of new prediction tool for increasing of litter size is important to swine industr
The prediction of sperm fertility is paramount importance for breeding animals. Howerer, none of many parameters addresses sperm function and their value in predicting fertility is questionable. Therefore, development of new prediction tool for increasing of litter size is important to swine industry. The objective of this study was to find biomarker for pridiction of litter size in swine. We employed a comprehensive proteomic analysis of porcine sperm, compared protein expression of sperm form high and low fertility in boar to characterize the differences in fertility at the protein level. The aim of the present study was to employ proteomic strategies potentially to identify, to fine the proteins involved in the relation to male fertility.
The main results of this research were as follows;
1. To determine the normal range for SPA, we established the lower limits of the sperm fertility index (SFI) and set the cut-off point at 1.2 or 2.5, at which litter size was less / more than 8 litter size, using the receiver operating characteristic curve. Overall accuracy was 95.45% and 93.18%, respectively.
2. High and low litter size smaples were selected based on field data, and then washed with PBS (3 times). Finally thes sample was stored in deep freezer (-80℃)
3. Samples were divided 2 group and then incubated with media (mTCM 199 + 10 ug/ml heparin). After incubation, samples were washed with PBS (3 times). Finally thes sample was stored in deep freezer (-80℃).
4. Motility (%) and Motion kinematics of samples were evaluated using CASA. All parameters were performed comparative analysis with litter size. However, these parameters were not significantly correlated with litter size.
5. Capacitation status of samples were evaluated using CTC staining. Analyzed capacitation status data were performed comparative analysis with litte size. AR pattern was significantly positively correlated with litter size. F pattern was significantly negatively correlated with litter size (P < 0.05).
6. To evaluate effect of male or female on litter size, Coefficient variation were canmparatively analyzed. As a result, the factor of male and female affect litter size.
7. Protein expression of before- or after-capacitation spematozoa were evaluated using 2D electrophoresis. Twenty spots were significantly differenty expressed more than 3-fold. Fifteen proteins were significantly increased after-capacitation and 5 proteins were significantly decreased after-capacitation. Signaling pathways if these proteins were searched using by Sgnaling pathway 9.0. MnSOD and PHGPx were correlated with ROS metabolism. PHGPX and PRDX5 were correlated with Glutathione metabolism. APOA1, SDHB, ECH, TPI were correlated with Adipocytokine signaling and Insulin action. CAPZB, TUBB4, APOA1, ECH, and TPI were correlated with Notch pathway.
8. Protein expression of different litter size before- or after-capacitation spematozoa were evaluated using 2D electrophoresis. Sixteen spots were significantly differenty expressed more than 3-fold. Signaling pathways if these proteins were searched using by Sgnaling pathway 9.0. SDHB, ECH, TPI, AK1 were correlated with Adipocytokine signaling. TUBB4, ECH, TPI, AK1, and CCT2 were correlated with Notch pathway. SDHB, ECH, TPI, and AK1 were correlated with Insulin action. TPI and AK1 were correlated with Mannose metabolism. SDHB and NDUFS3 were correlated with Respiratory chain and oxidative phosphorylation. PSMB7 was correlated with Presentation of endogenous peptide antigen and Ubiquitin-dependent protein degradation.
9. Expression of SDHB and ECH were analyzed from randomly selected 20 boarz spermatozoa after artificial insemination. Expression of SDHB was positively correlated with litter size. Expression of ECH was negatively correlated with litter size. We set the cut-off point at 3370000 and 4790000 of expression level of SDHB and ECH, at which litter size was more than 11 or 12 litter size, using the receiver operating characteristic curve. Overall accuracy was 80% and 75%, respectively. To our knowledge, this will enable further elucidation of the molecular mechanisms involved in this particular condition and might shed further light on key sperm proteins involved in capacitation and fertilization. It is also important prerequisite to the development of diagnostic tests to identify these men in a clinical environment, and in the future might also be applied to the development of novel methods of sperm targeted contraception.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 3
- SUMMARY ... 8
- 목차 ... 10
- 제 1 장 서 론 ... 11
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 12
- 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 13
- 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 40
- 1절 : 목표대비 대외달성도 ... 40
- 2절 : 정량적성과 ... 40
- 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 41
- 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 42
- 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 43
- 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 44
- 제 9 장 참고문헌 ... 45
- 끝페이지 ... 47
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