초록 ▼

니신은 Lactobactococcus latctis supsp. lactis에 의해 생성되며 치즈를 포함한 다양한 식품에서 사용되는 천연보존료이다. 본 연구는 LC-MS/MS를 이용하여 가공치즈 중 nisin A와 nisin Z의 분석법을 확립하고 타당성을 검증하기 위해 진행하였다. 분석법을 검증하기 위하여 가공치즈, 자연치즈, 우유를 시료로 사용하였고 시료중 nisin A와 nisin Z를 추출하기 위해 최적의 추출용매 조건을 확립하였다. 전처리는 시료에 추출용매를 첨가한 후, 균질화 및 원심 분리한 다음 상층액을 시험용액으로 하

니신은 Lactobactococcus latctis supsp. lactis에 의해 생성되며 치즈를 포함한 다양한 식품에서 사용되는 천연보존료이다. 본 연구는 LC-MS/MS를 이용하여 가공치즈 중 nisin A와 nisin Z의 분석법을 확립하고 타당성을 검증하기 위해 진행하였다. 분석법을 검증하기 위하여 가공치즈, 자연치즈, 우유를 시료로 사용하였고 시료중 nisin A와 nisin Z를 추출하기 위해 최적의 추출용매 조건을 확립하였다. 전처리는 시료에 추출용매를 첨가한 후, 균질화 및 원심 분리한 다음 상층액을 시험용액으로 하여 이를 LC-MS/MS에 주입하여 분석하였다. 추가적으로 측정불확도를 측정하였으며 교차 검증을 실시하여 확립된 분석법에 대해 검증하였다. 또한, 본 연구에서는 국내 유통 가공치즈 100건과 자연치즈 40건에 대하여 nisin A와 nisin Z의 함유량을 조사하였다. 추출용매의 구성은 1M NaCl을 함유한 pH 2.0의 acetate buffer와 메탄올을 1:1의 비율로 혼합한 용매로 치즈에서 nisin A와 nisin Z의 추출에 최적의 용매조건임을 확인하였다. 가공치즈와 자연치즈에서 nisin A와 nisin Z가 0.9996과 0.9991로 양호한 직선성(R²)을 나타냈으며 10.2 μg/kg과 12.6 μg/kg의 정량한계(LOQ)를 보였다. 또한, 회수율의 경우 84 ~ 114%의 범위에서 나타났으며, 정밀성은 0.2 ~ 2.6%로 확인되어 본 연구에서 확립한 분석법이 효율적인 방법임을 검증하였다. 한편, 확립된 분석법을 우유에 적용한 결과, nisin A와 nisin Z가 각각 0.9987, 0.9989의 직선성(R²)을 나타냈고, 각각 12.9 μg/kg과 10.9 μg/kg의 LOQ, 84 ~ 104%의 회수율과 0.3~ 0.6%의 정밀성을 나타내어 우유시료에 적용 가능한 분석법임을 확인하였다. 치즈 중 니신 분석법에 대한 교차검증을 실시한 결과, 87 ~ 90%의 회수율을 나타냈으며 1.1 ~ 5.0%의 정밀도로 확인되어 본 연구에서 확립한 분석법이 적용가능한 방법임을 객관적으로 검증하였다. 또한, 확립된 분석법에 대해 측정불확도를 구한 결과, 최종 결과 값이 2.5 mg/kg일 때, 95%의 신뢰수준에서 nisin A와 nisin Z가 0.13 mg/kg와 0.12 mg/kg의 불확도를 갖는 것을 알 수 있었다. 모니터링을 실시한 결과, 치즈 140건 중 nisin A는 2건(0.34 mg/kg과 0.48mg/kg), nisin Z는 1건(0.64 mg/kg)으로 3건 모두 네덜란드산 연성가공치즈에서 검출되었으나 그 이외의 치즈시료에서는 검출되지 않았다. 가공치즈에서 니신의 국내 허용기준이 250 ppm으로 설정된 점을 감안하면 검출량은 허용기준이내임을 알 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서 확립된 LC-MS/MS를 이용한 nisin A와 nisin Z의 분석법은 치즈 및 우유에 적용 가능한 방법임을 검증하였으며 국내 유통 치즈 중 nisin A와 nisin Z가 검출된 건수는 소수였지만, 니신은 나라별 사용기준이 다르고, 제외국인 경우 다양한 제품에 허용되어 있는 점을 감안할 때, 수입되는 축산식품의 안전관리 차원에서 니신의 지속적인 모니터링이 필요하다고 사료된다.

Abstract ▼

The peptide nisin produced by Lactobactococcus latctis supsp. lactis is known to be one of the natural preservatives that are used for various food including cheese products. This study optimized and validated a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) method for the analysis of nisi

The peptide nisin produced by Lactobactococcus latctis supsp. lactis is known to be one of the natural preservatives that are used for various food including cheese products. This study optimized and validated a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) method for the analysis of nisin A and nisin Z in process cheeses, natural cheeses, and milk. Optimal conditions for extraction solution of nisin A and nisin Z in cheeses were established. After adding extraction buffer to cheeses and milk samples, they were homogenized and centrifuged and then the supernatant was used for the analysis of LC-MS/MS. Additionally, the uncertainty of the developed method was measured and the cross validation against the method was performed. Moreover, this study investigated the content of nisin A and nisin Z in 100 process cheeses and 40 natural cheeses. The extraction solution composed of acetate buffer containing 1M NaCl with pH 2.0 : MeOH=1:1 was found to be the best condition to extract nisin A and Z from cheeses.
In process and natural cheeses, the linearities of developed method had good correlation coefficient (r²=0.9996 and r²=0.9991, respectively) and limit of quantification (LOQ)s of nisin A and nisin Z were approximately 10.2 and 12.6 μg/kg, respectively. The accuracy and precision revealed to be in the range of 84% ~ 114% and 0.2 ~ 2.6%, respectively. Also, in milk samples, linearities of the analytical method also had great correlation coefficient (r²=0.9987 ~ 0.9989) as cheese samples and the LOQ of nisin A and nisin Z were about 12.9 and 10.9 μg/kg, respectively. The accuracy and precision of analytical method of nisin A and nisin Z in milk exhibited to be the range of 84% ~ 104% and 0.3 ~ 0.6%, respectively. In addition, in cross validation against the analytical method of nisin in cheeses, thin study confirmed to have great accuracy and precision with 87% ~ 90% and 1.1 ~ 5.0% respectively. Moreover, this method had the uncertainty of 0.13 for nisin A and 0.12 mg/kg for nisin Z at 95% significant level if the final concentration is supposed to be 2.5 mg/kg. In monitoring study, only one soft process cheese out of 140 cheese samples had nisin Z (0.64 mg/kg) and two soft process cheeses contained nisin A (0.34 and 0.48 mg/kg). However, 97 process cheeses and 40 natural cheeses indicated to contain neither nisin A nor nisin Z. The levels of nisin A and nisin Z detected in three process cheeses were very small amount, compaired with permitted level of nisin (250 mg/kg) in process cheeses. In conclusion, this study suggests that the developed analysis method is an efficient method for determination of nisin A and nisin Z in cheese products and milk. Even though only three process cheese out of 140 cheese samples were found to contain nisin A or nisin Z, continuos monitoring against nisin in cheeses should be performed for the management of safe dairy products because the permitted levels and items of nisin are various in case of foreign countries.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
• 국문요약문 ... 3
• Summary ... 4
• 목차 ... 5
• 연구개발과제 연구결과 ... 7
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 7
• 제1절 연구개발과제의 목표 ... 7
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 7
• 제3절 연구개발 범위 ... 8
• 제4절 연구개발 추진체계 및 방법 ... 9
• 제2장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황 ... 10
• 제1절 니신의 물리.화학적 특성 ... 10
• 제2절 니신의 안전성 ... 12
• 제3절 니신의 국내외 지정현황 ... 13
• 1. 국내 지정 및 사용현황 ... 13
• 2. 국외 지정 및 사용현황 ... 13
• 제4절 식품 중 니신 분석법 연구동향 ... 16
• 1. 국내외 분석법 현황 ... 16
• 2. 분석방법 ... 16
• 3. 국내 니신 관련 연구 현황 ... 19
• 4. 치즈의 분류 ... 19
• 제5절 가공치즈의 수입현황 ... 21
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 22
• 제1절 연구수행 내용 ... 22
• 1. LC-MS/MS를 이용한 가공치즈 중 니신 분석 방법 ... 22
• 2. 니신의 안정성 시험 ... 25
• 3. 실험실간 교차검증 ... 25
• 4. 측정불확도(Uncertainty of measurement) ... 25
• 5. 우유에 니신 분석법 적용 ... 26
• 6. 국내 유통 치즈 중 nisin A 및 nisin Z 함유량 조사 ... 26
• 제2절 연구수행 결과 ... 27
• 1. 치즈 중 니신 분석법 확립 ... 27
• 2. 니신의 안정성(Stability) 실험 ... 38
• 3. 우유에 있어서의 니신 분석법 검토 ... 39
• 4. 실험실간 교차 검증 ... 43
• 5. 니신 시험법의 측정불확도 산출(Uncertainty of measurement) ... 44
• 6. 국내 유통 치즈 중 nisin A 및 nisin Z 함유량 조사 ... 53
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 74
• 제1절 치즈 및 우유 중 nisin A와 nisin Z의 시험법 확립 ... 74
• 제2절 가공치즈 및 자연치즈 중 니신 함유량 조사 ... 76
• 제3절 결론 ... 77
• 제5장 「식품 중 식품첨가물 분석법」책자 수재(안) 마련 ... 78
• 제6장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 81
• 제1절 연구개발과제의 목표달성도 ... 81
• 제2절 RFP이외의 추가도출 내용 ... 81
• 제3절 관련분야에의 기여도 ... 82
• 제7장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 83
• 제1절 활용성과 ... 83
• 제2절 활용계획 ... 83
• 제8장 참고문헌 ... 85
• 제9장 첨부서류 ... 88
• 끝페이지 ... 89