초록 ▼

최종 연구결과 요약
◦ 제1세부과제명: 최근 발생 PED 바이러스의 특성 및 병원성 조사
◦ 최근 PED 발생양상 조사 및 시료 수집
- 발생농가의 구간별 항체수준을 통해 감염유형을 파악코자 하였음. PED 발생 4농장은 발생 후 인공감염 또는 백신을 접종한 농가로 모돈에 대한 항체수준이 높고 70일령이후부터는 항체수준이 급격히 떨어지는 경향을 보이거나 포유모돈의 항체수준이 낮았음. 3회이상 지속 발생농가는 30일령부터 120일령까지 낮은 수준의 항체를 지속적으로 가지고 있었음
- ‘12년 및 ’13년 전남,

최종 연구결과 요약
◦ 제1세부과제명: 최근 발생 PED 바이러스의 특성 및 병원성 조사
◦ 최근 PED 발생양상 조사 및 시료 수집
- 발생농가의 구간별 항체수준을 통해 감염유형을 파악코자 하였음. PED 발생 4농장은 발생 후 인공감염 또는 백신을 접종한 농가로 모돈에 대한 항체수준이 높고 70일령이후부터는 항체수준이 급격히 떨어지는 경향을 보이거나 포유모돈의 항체수준이 낮았음. 3회이상 지속 발생농가는 30일령부터 120일령까지 낮은 수준의 항체를 지속적으로 가지고 있었음
- ‘12년 및 ’13년 전남, 전북, 충남 등지의 9개 PED 발생농장으로부터 감염 양성시료(분변, 장조직)를 확보하였으며, 이와 함께 기존 보관중인 ‘10년 설사분변 시료(8농가)를 이용하여 분석을 실시함
◦ PED 바이러스의 분자생물학적 특성 조사
- PED바이러스 총17주의 S, ORF3, E, M, N 유전자에 대한 염기서열을 분석함
- 대부분 최근 검출 국내 PED바이러스는 각 유전자별로 크게 2개의 그룹(G1 및 G2)으로 나뉘며, 백신주와는 다른 그룹을 형성하고 있음
- S유전자인 경우 앞에서 언급한것과 같이 크게 백신주가 속한 그룹(G1)과 대부분의 야외 주가 속하는 그룹 (G2)으로 나뉘며, G2는 다시 G2-1과 G2-2로 나뉨. 국내분리주의 상동성 분석결과 nucleotide(nt)는 91.4∼99.8%를 amino acid(aa)는 89.7∼99.7%를 보여 최대 약 10%이상 차이를 보임
- 이외의 각 유전자별 국내 분리주간 nt(aa) 상동성 분석 결과, E유전자는 93.5∼100%(94.7∼ 100%), M유전자는 96.0∼100%(96.0∼100%), N인 경우 93.2∼99.9%(92.5∼100%)였음. ORF3 유전자인 경우 백신 및 일부 중국주에서 유전자deletion이 확인됨
- 국내 시판 백신주와 국내분리주간 각 유전자별 상동성 분석결과 ORF3, E, S, N, M순으로 상동성이 낮았으며, S유전자인 경우 91.8∼99.3%(90.0∼98.9%)로 약10%의 차이를 보임
◦ 인공감염시험시 항원 정량에 필요한 유전자 정량검사법 확립
- 바이러스 항원 정량을 위해 Taqman real-time RT-PCR 및 RT-LAMP을 적용하였고, PED바이러스 특이 Primer 및 Probe를 Taqman real-time RT-PCR 및 RT-LAMP에 맞춰 제작함
- N 유전자 특이 Primer를 이용한 RT-LAMP(3.56×101copies)이 Taqman real-time RT-PCR (2.38×10²copies)보다 약 10배 높은 민감도를 나타냄
◦ PED 바이러스 병원성 시험을 위한 바이러스 증폭
- 정량검사법의 효능측정 및 예비적인 인공감염시험을 실시하기 위해 포유자돈 2두를 이용하여 보관중인 PED 양성(KDGG10YO주) 장 유제액을 구강 접종하였음
- 확립된 RT-LAMP을 이용하여 인공감염시켰던 돼지의 시간대별 설사분변에서의 바이러스량을 측정한 결과 6일간 약 10²～10⁵ copies수로 검출됨
◦ 포유 및 이유자돈에 대한 인공감염을 통한 병리조직학적 특성 조사
- 인공감염을 위한 바이러스는 Spike 전체 유전자 분석시 그룹별로 G2에 속하는 2013년에 검출된 KDGG13HWN주 및 G1에 속하는 2013년 검출된 KDGN13DJ주를 선정하였으며, RT-LAMP를 이용하여 각 바이러스별로 저역가(3 TCID₅₀/ml) 및 고역가(30 TCID₅₀/ml)로 준비하여 포유자돈에 인공감염시킴
- 인공감염 결과 두 바이러스 모두 저역가 및 고역가와 상관없이 구토, 설사를 비롯 탈수증상을 보였으며, 접종 8일(KDGG13HWN주) 및 10일째(KDGN13DJ주) 각 바이러스별 고역가에서 1두씩 폐사함
- 체중변화는 전반적으로 고역가 접종군에서 저역가 접종군에 비해 감소폭이 더 두드러졌으며, KDGG13HWN주가 KDGN13DJ주에 비해 더 감소하였음
- 인공감염후 14일간 일자별로 설사분변을 채취하여 배출되는 바이러스의 양을 RT-LAMP를 이용하여 측정한 결과, 두 바이러스 모두 저역가를 접종한 군에서 더 많은 바이러스를 배출하였음.
또한 KDGG13HWN주가 KDGN13DJ주 보다 바이러스 배설량이 많았음
- 소장에서의 Villus:crypt 비율변화를 측정한 결과 부검일자별(3일째 및 14일째) 및 접종역가별 두 바이러스간의 차이는 크지 않았으나, 접종 14일째 Villus:crypt 비율은 접종 3일째와 비교하여 다소 높아진 경향을 보였음
◦제2세부과제명: PED 항체검사법 개선 및 모니터링 검사 체계 구축
◦ 항혈청을 이용한 바이러스간의 항원성 및 중화시험 비교 분석
- PED 백신바이러스(2주) 및 야외 바이러스(3주, spike분석 기준으로 G1, G2-1 및 G2-2 그룹별 대표주)에 대한 항혈청을 돼지에서 생산함
- 생산된 항혈청 5종을 이용하여 백신바이러스(P5V주 및 SM98주)와의 교차반응성을 알아본 결과, SM98주가 전반적으로 교차반응성이 높은 것으로 분석됨
◦ 중화시험 대체용 IFA 항체검사 킷트 확립
- 판독이 용이한 PED IFA 킷트 제작을 위한 조건별 시험 결과, 백신바이러스를 접종(40 TCID₅₀/0.1ml)하고 약 15시간후 고정하였을 경우 가장 특이적인 염색 반응이 관찰됨
◦ 중화시험 대체 ELISA 검사법 확립
- PED 바이러스의 nucleocapsid(N) protein에 대한 재조합 단백질은 백신주와 야외주 유전자를 개별적으로 증폭 후 발현하였고, 재조합 단백질의 면역반응성 확인 후 순수 정제(55kDa)함
: sf9세포와 Hi5세포에서 발현한 야외주 유전자 및 백신주 유전자 유래 재조합 단백질을 야외주 및 백신주 접종 돼지 항혈청을 이용하여 western blot을 한 결과, 각각의 재조합 단백질은 야외주 및 백신주 돼지 항혈청 모두에 반응성을 보였으며, 야외주 유전자 유래 재조합단백질이 Hi5세포에서 발현량이 많았음
: Hi5세포에서 야외주 유전자 유래 N protein 발현량을 측정해 본 결과 MOI 10으로 접종한 후 4일째 가장 높은 단백질이 발현됨을 확인함
: ELISA개발을 위한 적정 코팅항원 농도는 550ng/ml, 돼지혈청은 100배 희석시 PED양성 혈청 및 음성혈청과의 반응이 비특이없이 뚜렷이 구분되어, 위의 조건으로 최종 indirect PED ELISA를 확립함
◦ 전국 항체 모니터링 검사 체계 설정
- 검사두수, ELISA 항체 결과에 따른 PED 항체 프로파일 등을 작성함

Abstract ▼

The number of porcine epidemic diarrhea (PED) cases has increased over the past 20years in Korea, with a major outbreak in 2013. A total of 17 Korean isolates from the years 2010 to 2013 were analyzed, and were divided into two groups for comparison of the spike (S), envelope (E), membrane (M), and

The number of porcine epidemic diarrhea (PED) cases has increased over the past 20years in Korea, with a major outbreak in 2013. A total of 17 Korean isolates from the years 2010 to 2013 were analyzed, and were divided into two groups for comparison of the spike (S), envelope (E), membrane (M), and nucleocapsid (N) genes with those of reference strains, vaccine strains, and previously identified isolates by means of phylogenetic analyses. The homology percentage of each gene with prototype CV777 indicates that sequence variability of the Korean isolates has been increased over the years when analysis of each five year intervals the year from 1993 to 2013; S genes observed highly changed at nucleotide (amino acid) level compared to other genes. The analysis of S gene data demonstrate that prevalent PEDV isolates in Korea are genetically diverse among themselves that their origins might be divided into three groups, Chinese-, Korean- and vaccine-like viruses. Moreover, each gene conserved relatively from S gene is supported increasing variation of among Korean PEDVs. Two vaccine strains showed different serological cross-reactivities with antisera against field PEDVs in serum neutralization tests. In terms of the biopathogenicity of Korean PEDVs, there were no differences in tissue tropism for villus enterocytes in the small intestine between the two selected Korean viruses and the previous PEDV reported by Kim and Chae (2003), which were found to be virulent and to cause severe villous atrophy. Thus, Korean PEDVs show slow evolution, are highly pathogenic, and are antigenically diverse.
Therefore, multilateral efforts to prevent future PED outbreaks are required.