보고서 정보
주관연구기관 |
경산대학교 한의과대학 |
연구책임자 |
박창국
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2001-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400017716 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
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키워드 |
신경보호.한방제제.뇌졸중.세포흥분성독작용.흥분성신경전달물질.neuroprotection.herbal medicine.ischemia.excitotoxicity.excitatory amino acid.
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초록
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본 연구과제에서는 뇌졸중 치료에 임상적으로 사용되고 있는 생약들의 신경세포 보호작용을 배양 신경세포를 이용하여 연구하고, 그 작용을 발현하는 유효생리활성 물질을 밝히며, 신경세포 보호작용을 나타내는 기전을 규병하고 또한 생약단미제 추출물의 국소뇌허혈 동물모델에서 뇌허혈관련 신경전달물질 함량 변화 및 뇌경색 부피에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
이 목적을 달성하기 위하여 일차적으로 한방에서 중풍 치료에 사용되고 있는 생약들 중에서 46종을 선정한 후 각각의 메탄올 추출물을 제조하여 배양된 대뇌피질 신경세포에서 흥분성 신경독성
본 연구과제에서는 뇌졸중 치료에 임상적으로 사용되고 있는 생약들의 신경세포 보호작용을 배양 신경세포를 이용하여 연구하고, 그 작용을 발현하는 유효생리활성 물질을 밝히며, 신경세포 보호작용을 나타내는 기전을 규병하고 또한 생약단미제 추출물의 국소뇌허혈 동물모델에서 뇌허혈관련 신경전달물질 함량 변화 및 뇌경색 부피에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
이 목적을 달성하기 위하여 일차적으로 한방에서 중풍 치료에 사용되고 있는 생약들 중에서 46종을 선정한 후 각각의 메탄올 추출물을 제조하여 배양된 대뇌피질 신경세포에서 흥분성 신경독성 억제효과를 발현하는 생약들중 석장포, 천궁, 당귀, 조구등을 선별하여 보고하였다. 선별된 생약뜯을 대상으로 신경세포 보호활성을 나타내는 유효성분을 추적하여 분리, 정제하였다. 석창포에서 분리한 총 15여종의 물질 중에서 신경세포 보호효과를 나타내는 유효성분은 주요 정유성분인 asarone 임을 밝혀내었으며, 이 결과의 열부는 별도의 과제에서 수행되어 보고하였고, 나머지 연구결과를 논문투고 준비중에 있다. 또한, 별도의 과제로 진행된 수용체 결합실험에서 석창포의 메탄올 추출물과 정유성분이 NMDA 수용체의 길항제로 작용함을 보고하였다. 석창포는 진정작용 및 자발운동 억제작용, 미약하기는 하지만 항경련작용이 있으며, 이 중의 어떤 작용은 asarone에 의한 작용임이 알려져 있다. 본 연구자는 석창포 또는 asarone이 NMDA 수용체 길항제로 작용하여 신경세포 보호효과를 발현한다는 것을 세계적으로 최초로 규명하여 보고하였으며, 이는 기존에 보고된 바 있는 석창포의 중추억제효과에 새로운 약리작용을 추가 발견한 것이므로 한 걸음 진보한 연구결과라 할 수 있다.
본 연구과제에서는 석장포의 신경세포 보호작용 뿐만 아니라 천궁, 조구등, 당귀에서 신경세포 보호직용을 나타내는 유효성분을 분리 및 정제하기 위해 활성을 추적하였다. 그 결과, 천궁에서는 Iigustilide가 흥분성 신경독성을 억제하여 신경세포를 보호하는 물질임을 밝혔으며, 당귀에서는 decursin이 유효물질임을 확인하였다. 이와 같은 성분은 이미 그 구조가 알려져 있는 성분이기는 하지만 손상된 신경세포에 대한 보호작용은 처음 연구된 것이어서 뇌졸중 치료제로서 사용하는 데 대한 적절한 근거를 제공할 수 있어 의의가 있다고 할 수 있다. 조구등의 경우 흥분성 신경독성 억제작용 뿐만 아니라 강력한 항산화작용이 있어 신경세포 보호효과 및 이미 보고된 바 있는 항경련작용 등에 기여할 것으로 생각된다.
선정된 생약의 추출물, 분획 및 정제성분을 대상으로 배양 신경세포를 이용한 흥분성 신경독성 억제작용과 항산화 작용을 연구하였으며, 유효활성 성분을 분리, 정제하여 그 약리작용 및 기전을 연구하였다. 본 연구를 통하여 그 동안 실험적 입증이 부족한 상태에서 뇌졸중 치료제로 사용되어 온 생약제제들 중에서 일부 생약들에 대한 약리작용과 기전을 설명할 수 있는 실험적 근거를 제시하였다. 뿐만 아니라, 본 연구에서 확립한 실험모델을 이용하여 천연물 library로부터 확보한 수십종의 정제성분에 대한 흥분성 신경독성 억제작용을 탐색한 결과, hesperetin을 비롯한 수종의 성분에서 그 효과를 확인하였다. 이와 같이 본 연구에서 확립한 연구방법 및 기술은 천연물질에서 신경세포 보호효과를 연구하는 데에도 널리 적용될 수 있는 유용한 실험방법이므로 앞으로 관련 연구의 활성화를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.
이와 더불어, 이들 생약제제의 추출물이 뇌졸중 동물실험모델에서의 생체내 효과를 얻기위하여 중대뇌동맥 폐색으로 유발한 뇌허혈 모델을 이용하여 연구하였다. 그 결과, 천궁과 조구등의 메탄올 추출물을 30 mg/kg로 복강투여한 후 현저히 뇌경색 면적이 감소함을 알 수 있었다. 당귀의 경우 10mg/kg(복강투여)에서 가장 효과적으로 뇌경색 면적을 감소시킴을 알 수 있었다. 석창포의 경우 10Omg/kg(경구투여)에서 효과적으로 뇌경색 면적을 감소시켰으며, Fos-like immunoreactivity를 이용한 실험에서도 조구등 및 석창포는 뇌허혈 동물모델의 뇌에서 c-fos gene expression을 증가시켰다. 또한 국소뇌허혈 동물모델에서 석창포 및 조구등 80% Me-OH추출물을 투여하여 microdialysis 방법을 통해 뇌허혈 관련 뇌신경전달물질인 amino acid 와 dopamine 및 그 대사물질의 함량변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 선조체에서 세포흥분성 독작용을 나타내는 glutamate, dopamine등은 감소시켰으며, 세포괴사 억제작용을 나타내는 GABA, taurine등은 증가시켰다.
이와 같은 연구결과는 상기 배양신경세포에서 얻은 연구결과와 서로 일치하는 연구결과로 볼 수 있다. 즉, 배양 선경세포에서 흥분성 신경독성을 현저히 감소시킨 천궁, 조구등 당귀의 경우 생체내 실험모델을 이용한 연구에서도 뇌졸중에서 나타나는 경색면적을 효과적으로 감소시킨 것이다. 이러한 연구결과는 중풍 치료제로 사용 중인 생약의 약리작용을 실험적으로 입증함으로서 한방의 과학화플 한발 앞당길 수 있는 결과로 생각된다. 특히 본 연구결과는 지금까지 사용되어 온 처방보다 더 치료효능이 뛰어나고 신경세포 독성이 적은 새로운 치료제 처방을 개발할 수 있는 기초가 될 귀중한 정보를 제공하였다. 또한, 특정 생약에서 약리작용을 발현히는 물질을 규명해 나감으로서 그 물질을 함유하는 약물을 개발하거나, 그 구조틀 변경하여 합성된 유도제 등을 활용한 약물개발에 활용될 수 있어서 학문적인 만족은 물론 응용가치가 큰 연구결과라 할 수 있다.
Abstract
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The aim of the present study was to investigate neuroprotective action of herbal medicine and its action mechanism as well as isolation and identification of the active principles.
The methanol extracts were prepared from 46 orienta1 medicines currently used for stroke treatment, and the effects
The aim of the present study was to investigate neuroprotective action of herbal medicine and its action mechanism as well as isolation and identification of the active principles.
The methanol extracts were prepared from 46 orienta1 medicines currently used for stroke treatment, and the effects were assessed on the excitotoxic neuronal cell death induced by L-glutamate(Glu) in primary cultured rat cortical neurons. The extracts form Angelicae gigantis Radix, Manitis Squama Acori graminei Rhizoma, Uncariae Ramulus et Uncus, Alpiniae Fructus, Paeoniae Radix, and Cnidii Rhizoma inhibited the Glu-induced neurotoxicity with the IC50 values of 95.2, 218.6, 263.3, 295.1, 297.9, 310.1, and 446.7 ㎕/㎍, respectively. The extracts from Arisaematis Rhizoma, Loranthi Ramulus, Anemarrhenae Rhizoma, Carthami Flos, C1ematidis Radix, Bambusae Concretio Silicea, and Angelicae koreane Radix also exhibited significant inhibition of the toxicity. 1n contrast, the extracts from Aconiti Tuber, Araliae cordate Radix, Curcumae Rhizoma, Leonuri Herba, Polygalae Radix, Salviae Radix, and Siegesbekiae Herba increased the Glu-induced toxicity at the concentrations of 500 and 1000㎕/㎍. Rest of the extracts evaluated in the present study showed minor or negIigible inhibition. Taken together, the oriental medicines including AngeIicae gigantis Hadix, Manitis Squma, Acori graminei Hhizoma, Uncariae Hamulus et Uncus, and Alpiniae Fructus appear to exert pharmacological effects through the inhibition of excitotoxic neuronal cell death.
Further studies were carried out to characterize active principles in these extracts. The methanol extract and the essential oil from Acori graminei rhizoma (AGR) were shown to inhibit excitotoxic neuronal death in primary cultured rat cortical cells. An active principle was isolated from the methanol extract, and identified as asarone. 1n the present study, neuroprotective actions and action mechanism of the purified asaorone as weIl as α-and β-asarone obtained commercially were investigated. Based on phase-contrast microscoplc examinations and lactate dehydrogenase activities in the media. asarone protected neurons from excitotoxity, and the effect was potent and selective against the NMDA -induced toxicity. The [3H]MK-801 bindings measured in the presence of glutamate and glycine were significantly reduced by asarone, elucidating NMDA receptor antagonist-like action. These results indicate that asarone is the major active principle in AGR exhibiting neuroprotective action against excitotoxicity through the blockade of NMDA receptor function.
In addition, the effect of methanol extract of several herbal medicine including AGR was evaluated on neuroprotective action using in vivo studies. Cerebal infarction volume and c-fos gene expression were measured in rats subjected to permanent focal cerebral ischemia induced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). Results showed that the methanol extract of AGR, Angelcae gigantis Radix, and Uncariae Ramulus et Uncus significantly reduced cerebral infarction volume and enhanced c-fos expression after MCAO.
The present study also investigated the effect of the methanol extract of AGR and Uncariae Ramulus et Uncus on the extracellular concentration of amino acids, dopamine and its metabolites in MCAO rats using in vivo microdialysis. Microdialysis probes were inserted into the lateral part of the caudate-putamen 2 hours before the experiment and microdialyzates were collected at 20 min inetervals and analyzed by HPLC. AGR reduced focal cerebral ischemia-induced increase of extracellular glutamate. On the other hand, the increase of GABA and taurine was enhanced after the treatment of AGR in the ischemia-induced rats. These results suggest that AGR can produce a neuroprotective effect against cerebral ischemia by regulating extracellular excitatory and inhibitory amino acid release in relation to the concept of excitotoxity in brain ischemia. Taken together, these results were consistent with data shown in the effect of AGR on the excitotoxic neuronal cell death induced by glutamate in primary cultured rat cortical neurons.
These results provided a strong evidence that oriental medicine can contribute to the the development of neuroprotective agents for the treatment of stroke.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제 출 문 ... 3
- 목 차 ... 4
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
- Project Summery ... 8
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 19
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 21
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 25
- 6. 첨부서류 ... 25
- 제1세부 연구개발과제 연구결과 ... 26
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 27
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 29
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 34
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 55
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 56
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 57
- 7. 참고문헌 ... 58
- 제2세부 연구개발과제 연구결과 ... 60
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 61
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 62
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 64
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 76
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 78
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 79
- 7. 참고문헌 ... 80
- 제3세부 연구개발과제 연구결과 ... 82
- 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 83
- 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 85
- 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 88
- 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 100
- 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 102
- 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 103
- 7. 참고문헌 ... 104
- 끝페이지 ... 104
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