초록 ▼

본 연구 개발은 신증후출혈열 예방혼합백신을 genetic lineage 1그룹에 속하는 한탄바이러스, 서울바이러스 등의 바이러스들과 2그룹에 속하는 푸우말라바이러스 등 2가지 이상의 혈청형 한타바이러스들에 의하여 많은 수의 신증후출혈열 환자가 발생하는 러시아에서 백신의 유효성을 증명하는 연구의 대규모 야외임상시험을 실시하여 혼합백신의 상용화를 이룰 수 있도록 기반을 조성하는 것을 본 연구의 진행 목표로 하였다. 연구사업 1차년도에서는 기존의 실험실 규모의 백신생산을 cGMP level의 백신생산 수준으로 향상시키며 또한 국제규격에

본 연구 개발은 신증후출혈열 예방혼합백신을 genetic lineage 1그룹에 속하는 한탄바이러스, 서울바이러스 등의 바이러스들과 2그룹에 속하는 푸우말라바이러스 등 2가지 이상의 혈청형 한타바이러스들에 의하여 많은 수의 신증후출혈열 환자가 발생하는 러시아에서 백신의 유효성을 증명하는 연구의 대규모 야외임상시험을 실시하여 혼합백신의 상용화를 이룰 수 있도록 기반을 조성하는 것을 본 연구의 진행 목표로 하였다. 연구사업 1차년도에서는 기존의 실험실 규모의 백신생산을 cGMP level의 백신생산 수준으로 향상시키며 또한 국제규격에 맞는 전임상시험을 실시하는 것을 목표로 하였다. 제1세부과제인 백신의 고품질 제품화 공정확립 및 생산부문에서는 1차년도에 소규모의 cGMP규격에 따라 전임상용 샘플을 제조하였고, 대규모 생산을 대비하여 MSV(Master Seed Virus) 와 WSV(Working Seed Virus) Bank를 확립하였다. 이에 대한 QC(Quality Control) 국제 규격에 따른 생물학적 제제 요구 사향에 적합한 시험방법을 구축하였으며 또한 기존의 방법을 개선할 수 있도록 각 단계별 시험항목을 개선하였다. 정제는 확립된 소규모의 정제방법에 따라서 대량 생산 시스템화하였다. 2차년도에서는 cGMP level의 백신 대량생산체제를 확립하고 임상용 백신의 생산을 시도하였으며. 또한 이러한 백신 생산에 필요한 Quality Control 시스템을 Requirements for biological substance No.44 (HFRS, WHO)의 규격에 따라 확립하였다.
제 2세부과제인 백신의 안정성 및 약효연구의 1차년도에서는 전임상용으로 제조된 샘플의 냉장 보관된 백신을 매 1개월 간격으로 3회 접종하여 생성된 면역반응을 형광항체법과 플라크감소중화항체법으로 검정하여 안정성을 확인하였다. 또한 공격감염실험을 통하여 백신의 방어력을 확인하였다. 2차년도에서는 백신의 실온에서의 안정성을 확인하고 이를 2차년도 상반기 중에 완료하였다. 또한 임상용 샘플의 제조에 따른 백신의 약효, 약리시험을 공격 감염을 통한 혈액중의 향체 역가를 형광항체법과 플라크 감소 중화항체법으로 검사하였다.
제 1위탁과제인 혼합백신의 동물에서의 독성연구에서는 랫드와 비글견에 대한 근육 단회투여 독성시험을 완료하여 전임상 시료에 독성과 부작용이 없음을 확인하였다.
제 2위탁과제는 러시아의학아카데미 소아마비-뇌염바이러스 연구소에서 수행하는 혼합 백신의 안정성 연구과제로 전임상 시험으로 확인된 독성시험을 통과하여 개발된 백신의 약효, 약리를 증명하는 연구를 통해 안전성, 면역성, 유효성이 확인된 백신 시제품을 러시아내 지원자들에게 예방 접종하여 인체를 대상으로 백신 접종으로 언한 부작용 발생여부를 확인하는 연구를 위한 허가 자료를 준비하였다.
지금까지 진행된 연구 결과로 볼 때 제품화를 위한 대부분의 실험 (Q.C 시험 항목 확립)이 끝났으므로 임상을 성공리에 진행한다면 향후 대량의 백신 수출이 가능할 것으로 판단된다. 현재까지 유럽에서 발생하는 신증후 출혈열의 주요 원인균인 푸말라바이러스를 예방할 수 있는 백신을 개발한 것은 우리 나라가 세계 최초이며 개발된 백신의 상용화를 이룩함으로써 전세계에 우리 나라 백신생산기술의 우수성을 알리는 기회가 되며 우리 나라 생물 제제 제조산업의 발전을 기할 수 있을 것이다.

Abstract ▼

PUUV exit not noly in Europe but also in Asia, especially in eastem parts of Russia, Japan and Korea. Recently, we confirmed HFRS patients infected with PUUV in Korea. Based on these results, for complete protection of HFRS occurring in Eurasia, an effective combination vaccine against HTNV PUUV inf

PUUV exit not noly in Europe but also in Asia, especially in eastem parts of Russia, Japan and Korea. Recently, we confirmed HFRS patients infected with PUUV in Korea. Based on these results, for complete protection of HFRS occurring in Eurasia, an effective combination vaccine against HTNV PUUV infection is urgently needed.
Recently we have developed a formalin inactivated suckling hamster brain derived PUUV vaccine to prevent PUUV infection and a HTNV-PUUV combination vaccine to prevent HFRS caused by HTNV and PUUV infection in the world simultaneously.
PUUV K27 strain isolated from a I-IFRS patient in Ufa, Bashikiria was used as seed virus. The total protein and myelin basic protein content of PUUV vaccine are 12 ug/dose and <0.01 ng/dose, respectively, as shown in Table 6. One dose of PUUV vaccine contains 5,120 unit/ELISA of virus antigen in 0.5 ml. Antibody responses of hamsters after inoculation of inactivated Hantavax and PUUV vaccine are shown below. Hamsters produced high titers of IF and N antibodies against HTNV and PUUV.
One dose of HTN-PUU combination vaccine contains both 5,120 unit/ELISA of HTNV and PUUV antigen in 1.0 ml. Antibody responses of hamsters after inoculation of O.lml. of combined HTN -PUU vaccine showed good IF and N antibody production against 2 viruses. Actually, combined vaccine produced higher N antibodies than monovalent vaccine.
To examine the potential usefulness of HTN-PLTU combination vaccine against NYRS and HPS caused by several hantavirus serotypes, we vaccinated hamsters with HTN-PLJU combination vaccine twice at one month intervals. They were challenged with 5 different serotype hantaviruses and tested immune response, incidence of viremia, and presence of virus in the target organs. Ten volunteers were also vaccinated with HTN-PUU combination vaccine and immune responses were analyzed. Inactivation of HTNV and PUUV in the vaccines with 0.4% formalin were confirmed by passing inactivated virus three times in Vero E6 cells and in suckling mouse and in suckling hamster brains.
There was no evidence of virus. replication in the inoculated cells, brains. There was no evidence of virus. replication in the inoculated cells, brains, and lungs of vaccinated suckling animals by IFA and nested RT-PCR. Three viral structural proteins in vaccines were detected by westem blot with HFRS covalescent sera.
Hamsters were given 0.1 ml of vaccine twice intramuscularly at a month interval and bled from retro-orbital sinus 30 days after each vaccination. Antibody titers were measured by IFA and PRNT against 5 serotype hantaviruses; HTNV strain Howang, SEOV strain 80/39, Belgrade/Dobrava virus (BEL/DOBV) strain Belgrade 1, PUUV strain K27, and New York virus (NYV). The mean IF antibody titers on 30 days after the first shot were 78.4, 68.8, 68.8, 37.9 and 15.6; mean N antibody titers were 65.4, 12, 6.1, 65.6 and 0.5 against HTNV, SEOV, BEL/DOBV, PUUV and NYV, respectively, The mean IF antibody titers on 30 days after the second shot were 686.9, 567.5, 550.4, 516.3 and 430.9. Mean N antibody titers were 710.8, 41.9, 24.3, 409.9 and 1.6 against HTNV, SEOV, BEL/DOBV, PUUV and NYY, respectively.
It was reported that HTNV, SEOV, and PUUV RNA could be detected in infected hamsters' lungs, kidney and blood by nested RT-PCR. Hamsters were infected with 1,000 pfu of each serotype of hantaviruses and then bled on regular intervals and lungs were excised on 30 days after inoculation of viruses. Sera from all infected hamsters have shown high antibody titers to homologous viruses by IFA and PRNT. Viremia and virus RNA in lungs could be detected from all of the infected hamsters by nested RT-PCR using serotype-specific primers
Vaccinated hamsters with HTN-PUU combination vaccine twice at 30 day intervals were challenged on 30 days after the second dose of vaccination with 6 different serotype hantaviruses: HTNV, SEOV, BEL/DOBV, PUUV, SNV and NYV. None of the vaccinated hamsters challenged with live HTNV, SEOV, BEL/DOBV, PUUV showed viremia, nor virus in lung tissues. In contrast, vaccinated hamsters challenged with live SNV and NYV showed viremia and virus in lung tissues. In immune response, the vaccinated hamsters challenged with HTNV, SEOV, BEL/DOBV, PUUV did not show significant increase of IF and N antibodies, but vaccinated hamsters challenged with SNV and NYV showed dramatic increase of N antibodies against NYV. In our limited study, 10 volunteers who are working with hantaviruses at our institute were vaccinated with HTN-PUU combination vaccine 3 times subcutaneously at one-month interva1s with various dose of the vaccine. AU vaccines produced relatively high IF antibodies (128-2,048) and a medium level of N antibodies (10-640) against homologous hantaviruses after the second and third vaccination. There was no side effect of combined vaccine among vaccines whom were vaccinated and not vaccinated with Hantavax before. HTN-PUU combination vaccine could be used after safety tests and a field efficacy trial in the endemic areas of HFRS where these 2 viruses coexist in the world.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목 차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 22
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 23
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 27
• 6. 첨부서류 ... 28
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 29
• 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 30
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 30
• 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 30
• 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 46
• 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 46
• 6. 제 1 세부연구개발과제의 활용계획 ... 49
• 7. 참고문헌 ... 50
• 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ... 51
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 52
• 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 52
• 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 53
• 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 67
• 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 68
• 6. 제 2 세부연구개발과제의 활용계획 ... 69
• 7. 참고문헌 ... 70
• 별첨 1 : 전임상 보고서 ... 71
• 끝페이지 ... 331