도파민 수송체는 의존성 약물의 작용 부위로서 중요할 뿐 아니라 측좌핵 등을 통한 의존성 발생에 있어서도 긴요한 역할을 수행할 것으로 생각되고 있다. 각종 약물의 의존성 발생 시, 도파민 수송체 유전자의 발현 변화가 보고되고 있는바 도파민 수송체의 발현 조절기전을 이해하는 일이 약물의존성 발생의 기전 규명에 중요하다. 도파민 수송체 의 5’-upstream 부위 및 intron 유전자 분리 human genomic DNA로부터 도파민 수송체의 promoter부위의 2.6kb를 PCR로 합성하여 염기서열을 분석한 결과 주형의
도파민 수송체는 의존성 약물의 작용 부위로서 중요할 뿐 아니라 측좌핵 등을 통한 의존성 발생에 있어서도 긴요한 역할을 수행할 것으로 생각되고 있다. 각종 약물의 의존성 발생 시, 도파민 수송체 유전자의 발현 변화가 보고되고 있는바 도파민 수송체의 발현 조절기전을 이해하는 일이 약물의존성 발생의 기전 규명에 중요하다. 도파민 수송체 의 5’-upstream 부위 및 intron 유전자 분리 human genomic DNA로부터 도파민 수송체의 promoter부위의 2.6kb를 PCR로 합성하여 염기서열을 분석한 결과 주형의 GC 비율이 86%로 높고 반복되는 염기서열이 많이 존재하며, Kouzmenko 그룹에 의해 보고된 5’- upstream 부위의 염기 배열과 비교했을 때 약 99% 이상의 homology를 가졌음을 밝혔다. 또한 2.2kb 의 첫 번째 intron 부위도 PCR로 합성하여 염기서열을 분석하였다. 제한효소를 이용하여 다양한 크기의 deletion mutant를 제조하여 전사활성을 조사하였다. 도파민 수송체 발현 세포 확인 RT-PCR 결과 PC12와 NG108에서 도파민 수송체 PCR산물이 합성되었으며, 도파민 수송능력을 측정한 결과 CVl, COSl, COS7, HEK293 세포주의 경우에는 매우 낮고, BE-2, Neuro2a의 경우에는 약간 높게 나타나며, PC12의 경우 가장 높은 도파민 수송능을 갖고 있었다. PC12 세포주를 도파민 수송체 발현세포주로 사용하여 일련의 실험을 진행하였다. Reporter gene assay에 의한 전사조절 활성 조사 신경세포주인 PC12 cell의 luciferase 활성도는 다른 세포주 보다 훨씬 높게 나왔다. 특히 pGL3-2526 ~ +63 이 transfection된 군에서 luciferase 활성이 매우 높게 나타났다. 또한 대부분의 신경 세포주에서 proximal promoter 부위인 pGL3-395/+63와 pGL3-240/+63에서 높은 luciferase 활성을 나타냈다. 도파민 수송체의 첫번째 intom 전체 (+71 ~ +2213)가 SV40 promoter 앞에 위치했을 때는 활성이 SV40 promoter 만 가진 control 보다 많이 낮게 나타났으며, deletion mutant들에서도 약간 낮게 나타났다. Foot printing 에 의한 특정 전사조절 부위 규명 PC12의 경우에는 HEK293, BE-2에 비해 그의 모든 부위가 DNase I 절단으로부터 보호되어 있다. 이는 이 부위 에 많은 DNA binding protein들이 결합하여 도파민 수송체 유전자의 positive regulation에 관여하고 있음을 말한다. 도파민 수송채 5’upstream 유전자 전사조절 부위의 규명 HEK293 세포주에서는 모든 clone 들이 SV40 promoter만 가진 control vector와 비슷한 활성을 나타냈으나, PC12 세포주에서는 -2526 ~ -2062 부위가 연결된 clone들에서 훨씬 높은 활성을 나타냈다. 이와 같은 결과를 토대로 -2526과 -2465 부위 사이에 promoter 활성에 중요한 역할을 하는 부위가 존재할 것이라는 가정을 할 수 있었다. 즉 이 부위에 dopaminergic neuron 특이적으로 전사 조절하는 단백질이 결합하는 부위가 존재함을 암시한다. 그 부위를 알아내기 위해 -2526 ~ -2062와 연결되어 있는 promoter clone의 -2526 ~ -2465내의 세 부위를 site directed mutagenesis 방법을 이용하여 mutation 시켰다. -2505 ~ -2503 mutation 의 경우는 wild type 과 비슷한 활성을 나타내는 반면, -2496 ~ -2494, -2488 ~ -2486 mutation 시켰을 경우는 promoter 활성이 wild type의 1/6 - ν8 수준으로 떨어졌다. 이와 같은 결과를 통해, -2526과 -2465 부위 중 -2496 부근과 -2488 부근이 각기 DAT promoter 활성에 중요한 영향을 미침을 알 수 있었다. gel shift assay 결과 HeLa, HEK293에는 shift된 banù들이 보이고, PC12와 NG108에서는 shift된 band가 없다. 도파민 수송체 전사조절 부위의 유전적 다형성 검증 정상인과 알코홀 중독자 각 20인의 혈액으로부터 유전체 DNA를 분리하고 -2526에서 -2060에 이르는 5’ upstream 부위의 염기서열 측정을 통하여 -2293부위에서 G/A 유전적 다형성이 존재함을 관찰하였음. 그 빈도는 정상인에서 15%, 알코흘 중독자에서 20% 이며, 알코홀 중독자에게만 나타나는 특이적 유전적 다형성은 관찰되지 않았다. 본 연구에서는 도파민 수송체의 발현에 있어 신경셔l 포에 특이적인 전사조절 인자가 결합하는 promoter의 특정 부위 를 mutantion에 의한 reporter gene assay와 footprinting, gel shift assay등을 통하여 규명하였으며, 또한 도파민 수송체의 첫 번째 intron 부위가 전사활성에 미치는 영향에 관해서도 조사하였습니다. 도파민 수송체 유전자의 5’-upstream -2506 ~ -2477부위가 positive regulation에 관련하고 있는 것으로 판명되었으며, 첫 번째 intron 이 negative regulation에 관여 함을 알 수 있었다. 그러나 promoter region 여러 곳에서 regulation에 관련되는 부위로 생각되는 곳이 많았으며, footprinting 의 결과에서 보듯이 도파민성 신경세포에서 수 많은 단백질들이 도파민 수송체 유전자 5’-upstream에 결합하여 상호 작용하고 있는 것으로 생각된다. 또환 gel shift 결과에서처럼 결합단백질이 repressor로 작용하여 비도파민성 세포에서는 도파민 수송체가 발현되지 못하게 하는 경우도 있는 것 같다. 이러한 결과는 도파민 수송체의 전사 조절은 어느 한 부위가 전체 전사 조절에 결정적 역할을 하는 것이 아니라 promoter 부위 외에 intron 부위도 관여하는 매우 복잡한 양식으로 이루어 지는 것 같다. 신경세포에 특이적인 전사조절 부위를 대상으로 유전적 다형성을 검증한 결과 몇 개의 다형성 표식자가 관찰되었으나 약물의존성 환자에게서 특정적으로 나타나는 유전적 다형성은 없었으며 이러한 유전적 다형성으로 인한 전사조절 활성의 차이도 관찰되지 않았다. yeast one-hybrid system을 이용하여 -2506 ~ -2477 부위에 결합하는 단백질을 분리하여 특성을 규명하고 있으며, 결합단백질이 밝혀지면 결합단백질을 이용하여 도파민성 세포에서의 전사 조절 기작을 밝힐 계획이다.
Abstract▼
Dopamine transporter is regarded to play an important role for drug dependency such as cocaine. In this study, we have tried to elucidate the transcriptional regulatory mechanism on dopamine transporter by isolating and characterizing the prom,oter region.. The promoter region of 2.6kb has been isol
Dopamine transporter is regarded to play an important role for drug dependency such as cocaine. In this study, we have tried to elucidate the transcriptional regulatory mechanism on dopamine transporter by isolating and characterizing the prom,oter region.. The promoter region of 2.6kb has been isolated and used for promoter assay using PC12 cells as a model, because it has a high activity of dopamine transporter. When various forms of deleted mutants of dopamine transporter were transfected into PC12 cells, pGL3-2526 - +63 showed the highest luciferase activity. Upon narrowing the bioloigcally active region, it was revealed that pGL3-395/+63 and pGL3-2401+63 has the highest regulationg activity. In addition to that, the first intron showed some regulating activity for the transcription of dopamine transporter. All the regions which has regulating activity has been protected from DNase I digestion suggesting they are the binding sites of many protein factors.. In order to find the dopaminergic neuronal specific regulating region, various cell lines have been assayed and compared with that of PC12 cell. The region encompassing -2526 - -2062 was identified as dopaminergic neuronal specific and some mutants were made to evaluate their regulating activity. While the mutant I (-2505 ~ -2503) showed no difference to that of wild type, mutant II (-2496 ~ -2494) and mutant III (-2488 ~ -2486) showed greatly decreased regulation activity by 1/6 to 1/8. In order to find polymorphism in promoter regions of dopamine transporter, genomic DNA of normal and patients with alcohol addiction were isolated and the sequences from -2526 to -2060 were determined. GI A polymorphism at -2293 was found and the incidence was 15% in normal and 20% in the patients with alcohol additiction.
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