보고서 정보
주관연구기관 |
성균관대학교 의과대학 Sungkyukwan University |
연구책임자 |
양준모
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참여연구자 |
안광성
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201400018108 |
DB 구축일자 |
2014-11-29
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키워드 |
돌연변이.유전성 피부질환.산전진단.keratin.transglutaminases.mutation.genetic skin diseases.prenatal diagnosis.
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초록
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유전성 피부질환은 현재로서는 치료가 불가능한 난치성 질환으로 세계적으로는 발생빈도가 높지는 않으나, 점차 발견률이 높아져 가고 있으며, 이들 유전성 피부질환에 대한 가계 구성원들의 원인 규명에 대한 인식 또한 증가 일로에 있다. 최근에는 분자 생물학적 기법을 이용한 유전자 치료법 (gene therapy)에 대한 관섬의 증가로 이들 가계에서도 유전성 피부질환의 원인규명에 대한 참여도가 높아, 환자 발견률이 점차 증가하는 추세에 있다. 대부분의 질환에 대한 연구는 완치를 목표로 하여 진행되어지는 것에 반해, 유전질환의 경우 그 원인올
유전성 피부질환은 현재로서는 치료가 불가능한 난치성 질환으로 세계적으로는 발생빈도가 높지는 않으나, 점차 발견률이 높아져 가고 있으며, 이들 유전성 피부질환에 대한 가계 구성원들의 원인 규명에 대한 인식 또한 증가 일로에 있다. 최근에는 분자 생물학적 기법을 이용한 유전자 치료법 (gene therapy)에 대한 관섬의 증가로 이들 가계에서도 유전성 피부질환의 원인규명에 대한 참여도가 높아, 환자 발견률이 점차 증가하는 추세에 있다. 대부분의 질환에 대한 연구는 완치를 목표로 하여 진행되어지는 것에 반해, 유전질환의 경우 그 원인올 알지 못하는 경우가 대부분이며 설혹 그 원언을 안다해도 현재로서는 치료법이 없으므로 산전 진단을 통하여 이들 질환이 후세로 유전되는 것을 방지하는 것이 가장 적절한 방법으로 생각된다. 최근 유전자 치료법을 이용하여 암, 선천성 면역 결핍증 등의 치료법을 개발하고는 있으나 유전자 치료법이 개발되기까지는 많은 기초 연구가 선행되어야하며 단시일 내에 이루어지기는 어려운 형편이다.
본 연구에서는 1) 임상적, 조직학적으로 유전성 피부질환에 합당한 단순성 수포성 표피 박리증, 표피박리성 과각화증, 수장족저 각화증, 선천성 경조종, 총판상 어린선 등의 환자 군을 수집하여, 환자에게서 혈액을 채취하여 DNA를 순수분리하고, PCR(polymerase chain reaction) 과 DNA sequencing을 이용하여 이들 DNA로부터 원인 가능한 keratin gene에서의 이상(mutation) 유무를 발견하여 mutation위치 (hot spot)를 찾아내고, 2) 원인이 밝혀진 가계에서는 임상양상과 돌연변이 사이의 상관관계에 대한 분석을 시행한다. 3) 원인을 찾지 못하는 가계에 대하여는 linkage analysis를 통하여 새로운 유전자의 가능성에 대한 연구와, genomic 및 cDNA library screen을 통하여 새로운 candidate gene인 K2e, K2p 및 IFAP의 gene을 clone하고 이들 gene의 구조와 조절기능 (regulation)을 연구하고, 4) 정상인 및 질환 군에서 TGase의 age, sex, 부위별로 표현정도를 밝혀, keratin 및 IFAP와 TGase 사이의 관계를 밝히고, 5) de-epidermized dermis에 mutant cDNA를 permanent transfection시킨 keratinocyte를 분주하여 tissue culture model을 개발함으로써 gene therapy에 응용할 수 었는 model을 수립하며, 6) 유전성 피부질환이 있는 가계에서의 산전진단으로 정상아 분만을 유도하는 것을 목표로 하고 있다.
본 과제에서는 2개의 세부과제로 구분하여 실험을 진행하였으며, 각 세부과제별 연구 내용 및 결과는 다음과 같다.
제 1 세부과제에서는 유전성 피부 질환 중 표피박획성 과각화증, Siemen형 어린선, 표피박리성 수장족 저각화증 및 층판상 어린선의 환자를 모아서 이들의 원인 유전자로 알려진 K1/10, 2e, 9 및 TGM 1에서 돌연변이에 대한 검색을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
① NPS로 확인된 표피박리성 과각화증 환자에서 K10의 1A domain에 있는 alanine이 proline으로 바뀌어진 것을 발견하고 이 alanine을 여려 가지 아미노산으로 대치하여 본 결과 이 돌연변이가 처음으로 보고되는 중요한 것임을 보고하였다. (J. Invest. Deramtol 109:692-694, 1997).
② 또한 Siemen형 어린선에서 K2e에서 써로운 돌연변이를 발견(T485P), 발표하였다 (J. Invest. Deramtol., 109:116-118, 1997).
③ 표피박리성 수장족저 각화증과 Siemen형 어린선에서 타 국가에서 흔히 발견되는 돌연변이가 한국에서도 또한 많이 있음을 발표하였다 (Acta. Derm. Venereol(Stockh)., 78:412-416 & 417-419, 1998).
④ 이외에도 keratin유전자의 경우에 keratin overlap이 되는 부위, 즉 1A의 앞쪽과 2B의 끝쪽, 중 특히 1A의 10번째 아미노산인 Arginine이 가장 흔히 돌연변이를 유발하는 부위임을 발표하였다 (J. Dennatol. Sci.,19:126-133, 1999).
⑤ Siemen형 어린선은 과거에는 표피박라성 과각화증의 아주 약한 형태로 분류되어 그 병명 자체가 없어진 때도 있었으나 분자생물학의 발달로 원인 유전자가 표피박리성 과각화증과 다른것으로 판명되면서 병명을 유지하게 되었다. 본 팀에서는 영상적으로는 Siemen형 어련선과 유사하지만 수장족저를 침범한 환자를 발견하고 이 환자의 원안 유전자를 검색하여 K1의 2B domain에 있는 glutarnate가 asp따tate로 바뀐 것을 발견하였다 (J. Invest. Deramtol., 112:376-379,1999), 이는 아직도 임상적으로 두 질환을 구분하가 어력운 경우가 많으며 이때는 원인 유전자의 돌연변이를 규명하여야만 한다는 것을 입증한 경우이다.
⑥ 상기에 언급된 가계 중 표피박리성 수장족저 각화증 가계에서 산전진단을 시행하였으며, 이를 통하여 1명의 정상아를 분만하게 하였으며, 한 명에서는 태아가 원인 유전자의 돌연변이를 가지고 있음을 밝혔다. 이 결과를 국제학회에서 발표하였다.
⑦ 층판상 어린선의 경우에도 5가계에서 환자를 발견하여 이중 한 가계에서 원인 유전자인 TGM 1에서 돌연변이를 발견하고 이를 국제학회에서 발표하였으며, 현채 돌연변이된 cDNA에서 enzyme acrivity를 측정하는 실험을 시행 중에 있다.
제 2 세부과제의 연구내용과 결과는
1. Linkage analysis를 통한 새로운 유전자의 분석: 현재까지 원인이 밝혀지지 않은 case는 모두 다 sporadic case로 판병되었고, 유전성 피부질환을 가지고있는 큰 가계를 확보하지 못한 상태여서 línkage analysis가 불가능하여 새로운 candidate gene올 찾을 수가 없었다.
2. TGase expression pattern을 보기 위한 RT-PCR:. Transglutaminase는 cross-linking을 통하여 조직의 tíghtness를 종가시키는데 없어서는 안될 중요한 효소로 인식 되어왔으며 최근 들어 lamellar ichthyosis에 관여하는 것으로 보고되었다. 그러나 기존의 TGase에 관한 연구는 anti-SPR antibody인 BC1 antibody를 이용한 결과였고, 특히 나이별, 성별 각 부위별 TGase의 표현 정도에 대한 연구는 전무한 형편이다. 이에 우선적으로 피부과 또는 성형외과에서 얻는 정상인 피부조직을 아용하여 TGase 1, 3의 mRNA의 양을 측정하여 TGase의 발현 양상을 조사하였다. TGase의 표현 정도를 보기 위하여 피부조직에서 추출한 전체 RNA (total RNA)을 가지고 Northern blot을 수행한 결과 TGase것으로 보이는 band를 볼 수 없었다. 이는 TGase mRNA의 양이 우리가 예측하였던 것 보다 적거나 사용했던 조직이 오래되어 RNA가 분해되었던 것으로 사려되어 좀더 민감한 RT-PCR을 이용하였다. RT-PCR에서 TGase 1과 2에 상응하는 RT-PCR product는 관찰 할 수 있었으나 TGae 3에 상응하는 band는 관찰 할 수 없었다. 이 결과는 이후 TGase가 관여되는 피부 질환에서 TGase mRNA와 그에 상응하는 단백질의 양 및 immunohistochemistrγ를 통한 TGase expression pattern을 비교할 수 있는 기틀을 마련하였다.
3. TGase 기능을 밝히기 위한 yeast two-hybrid system: 유전성 피부 질환의 원인을 밝혀내기 위하여 유전성 피부질환을 일으킬 가능성이 있는 keratin gene이나 KlF, IFAP (intemediate filament associated protein)의 분석이 선행되어야 한다. Keratin gene중 현재 K2e나 K9의 경우는 이들의 counter part가 되는 keratin이 무엇인지 밝혀져 있지 않은 상태이다. IFAP는 KlF와 기능은 유사하나 DNA구조가 다른 형 태의 단백질로 loricrin, involucrin 등이 모두 여기에 속하며 상당히 많은 종류의 단백질이 밝혀져 있으나 DNA 구조가 밝혀진 것은 많지 않다. 이러한 많은 종류의 단백질끼리의 상호 연관 관계를 밝히기 위하여 yeast two-hybrid system을 도입 TGase, KlF 및 IFAP의 가능을 밝히고자 한다. 이를 위하여 현재 TGase 1, 2, 3 및 IFAP인 involucrin, loricrin등의 cDNA를 얻었고 이들을 yeast expression vector 인 pACTⅡ plasmid에 subclone 중에 있다.
Abstract
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Genetic skin diseases are one of the non-treatable at present. Although the prevalence rate is not so high, there are increasing rates to find the genetic diseases and the desire to find the etiology. The more the development of the molecular biology and the possibility of the gene therapy, the more
Genetic skin diseases are one of the non-treatable at present. Although the prevalence rate is not so high, there are increasing rates to find the genetic diseases and the desire to find the etiology. The more the development of the molecular biology and the possibility of the gene therapy, the more the expectations of these families to treat the diseases. The final goal of the researches of the disease is to eradicate the etiology of the diseases. But, in case of genetic skin diseases, we did not know the causative etiology in most of the cases, and even if we knew the etiology, there is no treatment methods till now. It is our best to find the etiology in these cases and to prevent the delivery of the disease-can-ying fetus by prenatal diagnosis. Although there are some trials to treat the cancer or congenital immunodeficiency diseases by gene therapy, it will take a long time to settle the gene therapy and need a lot of experiments.
The purposes of this research are 1) to investigate the epidermolysis bullosa simplex(EBS), epidermolytic hyperkeratosis(EHK), ichthyosis bullosa of Siemens' CIBS), palmoplantar keratoderma(PPK), pachyonychia congenita, lamellar ichthyosis(LI) to find the mutations in each possible gene by direct DNA sequencing and to verify the hot spots in each gene, 2) to evaluate the correlations between clinical findings and sites of the mutation, 3) to find the possible gene by linkage analysis, to explore the gene sequence and to study its regulations, 4) to check the expression levels of transglutaminases according to the age-, sex-, and site-dependent, 5) to settle the tissue culture models using deepidermized epidermis for the future gene therapy, and finally 6) to settle the prenatal diagnosis in these families.
This research has been divided into 2 parts and the results of each parts are as follows; The first part was focusing on the mutation studies and the prenatal diagnosis
① We found the mutation in 1A rod domain of KlO in NPS type EHK (alanine to proline), experimented to change the alanine to several other amino acids and found this alanine was very critical to the filaments assembly (J. Invest. Deramtol 109:692-694, 1997).
② We reported T485P mutation in the end of 2B rod domain of K2e in IBS (J. Invest. Deramtil., 109:116-118, 1997).
③ We reported that the same mutations frequently reported in the other country were also found frequently in Korea in epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK) and IBS (Acta. Derm. Venereol(Stockh)., 78:412-416 & 417-419, 1998).
④ The overlap window of keratin gene-beginning of 1A rod domain and end of 2B rod domain-has been known as a hot spots of the keratin gene mutations. We found the arginine of the 10th position in the beginning of the 1A rod domain is a real hot spots in keratin 10 gene (J. Dennatol. Sci.,19:126-133, 1999).
⑤ Previously, IBS were treated as a mild form of EHK. We found the patient who had a very mild disease clinically and histopathologycally not to differentiate IBS or EHK. Upon molecular study, we found the E106D mutation at the end of 2B domain in K1. That means there are still diseases which we can not differentiate easily by conventional methods (J. Invest. Deramtol., 112:376-379,1999).
⑥ We did the prenatal diagnosis twice in EPPK family. One iwas normal and the other one had disease-causing mutant gene. We reported this result in the SID.
⑦ We have been looking for the mutations in TGM 1 gene in 5 LI families and found the mutations in one family. Now we are working on the experiments to check the enzyme activity of the mutant eDNA by baculovirus expression system.
The results of the second part of the research are
1. To find the new candidate gene by linkage analysis: All the patients whom we could not find the mutation were sporadic cases, so we could not perform the linkage analysis so far.
2. RT-PCR to check the enzyme activity of TGases: First, we check the mRNA levels of the skin samples from dermatology or plastic surgery by Northern blot assay. But we could not find the expected bands because there might be too small amounts of TGases or degradation of the mRNA due to the long preservations. So we change the methods to RT-PCR whoch is more sensitive than Northern blot. As expected, we could find the expected band of TGase 1 and 2, but we could not find the TGase 3 band. This result is going to apply to the other disease which TGase is working on.
3. Yeast two-hybrid system: There are lots of proteins expressed in the epidermis which include keratin intermediate filaments (KIF) and intermediate-filaments associated proteins (IFAP). We still did not know the counter parts of K2 or K9, and structures of lots of IFAP. We tried to verify the functions of the TGase, KIF and IF AP. For these, we subclone the cDNAs of TGase 1, 2, 3, involucrin, and loricrin to pACTH yeast expression vector.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
- Project Summery ... 7
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 17
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 19
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 20
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 23
- 6. 첨부서류 ... 23
- 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 24
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 25
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 26
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 30
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 31
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 32
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 34
- 7. 참고문헌 ... 35
- 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 36
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 37
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 38
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 41
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 42
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 43
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 44
- 7. 참고문헌 ... 45
- 끝페이지 ... 45
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