초록 ▼

국산 생약인 천마(Gastrodia elata Blume)부터 새로운 형태의 신경안정제를 개발하고자하는 본 연구과제의 목표달성을 위하여 천마로부터 항산화활성 및 γ-aminobutyric acid(GABA) 성 신경전달 항진작용이 우수한 분획으로부터 활성물질을 단리하고 그 구조를 규명하여, 그와 동일한 물질을 합성하고 관련유도체를 합성하여 이들의 약동, 약력학적 특성을 검색하여 신약개발의 기본자료를 마련하고자 하였다. 천마 butanol 분획중 GABA_A-benzodiazepine(BZD) 수용체 복합체에 가장

국산 생약인 천마(Gastrodia elata Blume)부터 새로운 형태의 신경안정제를 개발하고자하는 본 연구과제의 목표달성을 위하여 천마로부터 항산화활성 및 γ-aminobutyric acid(GABA) 성 신경전달 항진작용이 우수한 분획으로부터 활성물질을 단리하고 그 구조를 규명하여, 그와 동일한 물질을 합성하고 관련유도체를 합성하여 이들의 약동, 약력학적 특성을 검색하여 신약개발의 기본자료를 마련하고자 하였다. 천마 butanol 분획중 GABA_A-benzodiazepine(BZD) 수용체 복합체에 가장 강한 효현활성을 보인 분획의 미지물질의 구조가 페놀성 배당체나 saponin 이 아닌 다른 종류의 배당체가 함유되어 있는 것을 성공적으로 규명하였다. 특히, 이 효현활성 물질은 천연물로서나 합성에 의해서도 아직 보고된 바 없는 신물질로 CG98로 명명하였으며, 유도체 합성을 진행중이며, 일부 후보물질들의 활성 검색은 이미 검정되었다.
천마 ether 분획중 GABA transaminase(GABA-T) 저해 활성이 가장 강한 천마성분인 4-hydroxybenzaldehyde(4-HBA) 과 그 유도체들의 활성을 검색하였으며, 4-HBA, 3,4-dihydroxy benzaldehyde(3,4-DHBA), 2,4-dihydroxybenzaldehyde(2,4-DHBA),3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde(3-M-4-HBA) 이 현저한 억제활성를 나타내었다.
3-M-4-HBA는 흰쥐에서 PTZ 투여에 의한 GABA-T 활성의 증가를 유의하게 억제하였으며, 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid는 PTZ유발 경련을 유의하게 억제하였다.
2,3-DHBA와 3 ,4 -DHBA는 가장 뛰어난 항산화작용을 나타내었으며, 2,3-DHBA 의 생체내 항산화활성을 검색한 결과결과, 2,3-DHBA는 PTZ투여로 인한 과산화지질 생성량 증가를 유의하게 억제하였으며, 감소된 GSH 함량은 유의하게 증가사켰다. GABA-T억제활성이 우수한 것으로 선별된 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde(4-H-3-MBA)는 benzodiazepine수용체 길항제인 [³H]Ro15-1788과 효현제인 [³H]Flunitrazepam 의 결합반응을 억제하였다. 4-H-3-MBA는 benzodiazepine수용체 효현제인 [³H]flunitrazepam 의 수용체 결합반응을 억제시켰으나, 120 mM NaCl 및 20 μM GABA 존재하에서는 방사성효현제의 결합반응을 항진시킴으로써 4-H-3-MBA는 GABA_A-benzodiazepine 수용체 복합체상의 benzodiazepine 결합부위가 아닌 다른 결합부위에 작용하여 benzodiazepine 수용체 효현제의 결합을 증강시키는 것으로 추정되었으며, 더욱이 생체내에 존재하여 합성 benzodiazepine과 동일한 양상으로 GABA성 신경전달을 항진시키는 작용이 있는 것으로 보고된 천연물질인 내인성 benzodiazepine 수용체 효현제의 존재와 4-H-3-MBA 의 GABA-T 억제활성을 미루어 볼 때 상기의 연구결과들은 이 물질의 신경안정작용을 시사하는 충분한 시험관내 data 로 생각되었다.
시험관내 실험결과 신경안정작용이 시사된 3-M-4-HBA 의 생체(어린 흰쥐)내 항경련작용의 확인을 위하여 실시한 pentylenetetrazole-유발 사망률검색에서 3-M-4-HBA 단독투여 (100mg/kg, 1일 1회 7일간, 경구투여)는 유효하지 않았으나, 항산화작용이 우수하다고 선별된 2,3-DHBA 와의 병용투여는 사망률을 유의하게 감소시킴으로써 항경련작용을 나타내었으며, 3-M-4-HBA 와 2 ,3-DHBA 의 병용투여는 pentobarbital 유발 수면시간을 연장시키는 진정 및 최면작용도 나타내었다. 그러나, 3-M-4-HBA와 2, 3-DHBA 의 병용투여는 근이완작용이나 불안해소작용을 나타내지는 않았다. 이와같이 3-M-4-HBA와 2,3-DHBA 의 병용투여에 의한 생체내 신경안정작용을 확인하였으며, 새로운 신경안정제 창출을 위한 중요한 정보로 생각되었다.
4-H-3-MBA, 4-HBA와 4-hydroxybenzoic acid등 3가지 천마에서 단리된 유효성분과 함께 2,4-DHBA와 3,4-DHBA 2가지 성분의 체내약물동태를 규명하였으며, 5가지 성분을 흰쥐에 투여시 모두 체내에서 신속히 소실되어 짧은 생체반감기를 갖는 것으로 확인되었으며, 상대적으로 2, 4-DHBA(반감기 약 38분)만 생체반감기가 다소 길게 나타났다.
뿐만아니라 이들 유도체들의 Total Clearance, AUC, MRT, Urinary Excretion Fraction 및 Biliary Excretion Fraction data를 확보하였다. 천마의 유효성분 4-HBA 와 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid의 일반약리 작용을 검색결과, 경련 유발, 체온 및 수변에 대한 작용은 없었으며, 위장관계에 대한 일반약리 작용 검색결과, 위와 십이지장 점막에 대한 자극효과, 장관 수송능에 대한 작용 및 적출장관근 수축력에 대해 별다른 영향을 미치지 않았다. 이들 약물을 투여하였을 때 평균혈압이 유의성있게 감소되는 것을 확인하였다. 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid(4-H-3,5-DMBA), 2,4-DMBA, 4-HBP, 2,4-DHBA, 3,4-DHBA, 4-HBC는 회장 평활근의 acetylcholine 유발 수축에 대해 별다른 영향을 미치지 않았다. 4-H-3,5-DMBA, 2,4-DHBA, 4-HBP, 및 4-HBC등의 각 유도체들은 흰쥐의 혈압에 별다른 영향을 미치지 않았으나, 2,4 -DMBA 와 3,4-DHBA 의 경우는 혈압강하작용이 관찰되었다. 각 유도체는 pentobarbital로 유도된 수면의 정향반사 소실시간 및 수면시간에 대해 영향을 나타내지 않았고 자발운동량에 대해서도 영향을 미치지 않았다.
쥐의 정상체온에 대해서도 각 유도체는 영향을 미치지 않았다. 사람 간세포 HepG2에 대한 세 포독성 검사를 실시한 결과, 4-H-3,5-DMBA, 2,4-DHBA, 3,4-DHBA, 및 4-HBC 는 세포생존율을 감소시키지 않았으나, 2,4 -DMBA 와 4-HBP 의 경우는 세포생존율을 감소 시켰으며, 사람 뇌세포 IMR32 세포에 대해서는 유도체 모두 세포 생존율을 감소시켰다.

Abstract ▼

Tianma, Rhizoma Gastrodiae, is the dry tuber of Gastrodia elata Blume(Orchidaceae).
It is officially listed in the Chinese Pharmacopeia and used as an anticonvulsant, and sedative against vertigo, general paralysis, epilepsy, and tetanus, Chemical studies have shown that the Gastrodia elata Blume

Tianma, Rhizoma Gastrodiae, is the dry tuber of Gastrodia elata Blume(Orchidaceae).
It is officially listed in the Chinese Pharmacopeia and used as an anticonvulsant, and sedative against vertigo, general paralysis, epilepsy, and tetanus, Chemical studies have shown that the Gastrodia elata Blume rhizome contains mainly 4-hydroxybenzyl alcohol, 3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde(3-M-4-HBA) and 4-hydroxybenzaldehyde(4-HBA), the Gastrodia elata Blume rhizome also contains other components, such as amino acids and trace alkaloids. Pharmacological studies have shown that Gastrodia elata Blume extract, given intravenously, increased the threshold of electroshock-induced convulsions, and inhibited the occurrence of seizures in experimentally epileptic guinea pigs, it exhibited sedative effects in both the rat and mouse and had a hypotensive action in the dogs, rabbits and rats. It has been reported that the antioxidant mechanism, affecting lipid peroxidation in brain and antioxidant enzymes are related to the anticonvulsant mechanism of Gastrodia elata Blume. It has been also suggested that GABAergic neuromodulation may be involved in the anticonvulsant mechanism of Gastrodia elata Blume.
In this study, we sucessfully isolated active and synthesized derivatives. Among them, ingradients from Gastrodia elata Blume CG98 has been observe to be a benzodiazepine receptor agonist. 4-HBA, 3,4-dihydroxybenzaldehyde(3,4-DHBA), 2,4-DHBA(2,4-dihydroxybenzaldehyde), 3-M-4-HBA potently inhibited GABA transaminase activity in vitro, and 3-M-4-HBA did it in vivo. 2,3-DHBA and 3,4-DHBA showed excellent antioxidant effect in vitro. and 2,3-DHBA did it in vivo.
We also estabilished pharmacokinetic data for these materials. In the experiment for general pharmaology and cytotoxicity, active ingradients from Gastrodia elata Blume showed fewer adverse effects than synthetic derivatives.
3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde and 4-hydroxybenzaldehyde, major components isolated from Gastrodia elata -Blume, inhibited activities of GABA transaminase in a concentration-dependent manner. 3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde enhanced the binding of [³H]f1unitrazepam, a benzodiazepine receptor agonist to the benzodiazepine receptor in the presence of GABA.
Reduced lethality of pentylenetetrazole-induced convulsion was observed in the repeatedly treated with 3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde and 2,3-dihydroxybenzaldehyde, a synthetic derivative having strong antioxidant activity, but not in the rats treated with each compound. Combined administration of 3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde and 2,3-dihydroxybenzaldehyde enhanced the pentobarbital-induced sleeping time in young rats, however, did not elicit anxiolytic and muscle relaxant effects.
From these results, it can be summarized that 3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde, an active ingradient of Gastrodia elata Blume may exert positive modulatory effect on GABAergic neurotransmission via GABA transaminase inhibition and GABA_A receptor agonism, and coadministration of antioxidant may exert positive effect on the enhancement of GABAergic tone. Furthermore, it may be concluded that all data from in this study can be imfortant informations for the establishment of new treatment modality as CNS depressants.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
• Project Summary ... 8
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 18
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 19
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 21
• 6. 첨부서류 ... 21
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 22
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 23
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 23
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 23
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 26
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 27
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 27
• 7. 참고문헌 ... 27
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 28
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 29
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 30
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 32
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 39
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 42
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 43
• 7. 참고문헌 ... 43
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 47
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 48
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 49
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 53
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 64
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 66
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 67
• 7. 참고문헌 ... 67
• 제4세부연구개발과제 연구결과 ... 69
• 1. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 70
• 2. 제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 71
• 3. 제4세부연구개발과제의 최종 연구 개발결과 ... 75
• 4. 제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 83
• 5. 제4세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 83
• 제5세부연구개발과제 연구결과 ... 89
• 1. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 90
• 2. 제5세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 90
• 3. 제5세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 91
• 4. 제5세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 99
• 5. 제5세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 100
• 6. 제5세부연구개발과제의 활용계획 ... 101
• 7. 참고문헌 ... 101
• 끝페이지 ... 103