초록 ▼

본 과제는 현재 유럽에서 사용되고 있는 겨우살이 제재 항암제보다 한국산이 더 효과적이다라는 결과에 기초하여 한국산 겨우살이에 존재하는 항암활성을 갖는 주성분을 분리， 정제하여 물질의 이화학적 특성은 물론 항암활성의 기전연구 그리고 일반약리 및 예비독성시험을 행하여 새로운 항암제 개발을 위한 기반을 화립하는데 궁국적 목적을 두고 연구를 수행하여 얻은 중요연구 결과들을 내영별로 요약하변 다음과 같다.
1. 한국산 겨우살이로부터 분획 및 주성분 분리，정제와 특성 조사
1) 단백질 성분
단백질 성분은 lectin과 비 le

본 과제는 현재 유럽에서 사용되고 있는 겨우살이 제재 항암제보다 한국산이 더 효과적이다라는 결과에 기초하여 한국산 겨우살이에 존재하는 항암활성을 갖는 주성분을 분리， 정제하여 물질의 이화학적 특성은 물론 항암활성의 기전연구 그리고 일반약리 및 예비독성시험을 행하여 새로운 항암제 개발을 위한 기반을 화립하는데 궁국적 목적을 두고 연구를 수행하여 얻은 중요연구 결과들을 내영별로 요약하변 다음과 같다.
1. 한국산 겨우살이로부터 분획 및 주성분 분리，정제와 특성 조사
1) 단백질 성분
단백질 성분은 lectin과 비 lectin성분으로 나누어 연구를 수행 특히 lectin성분에 초점을 두고 주로 affinity chromatography 법과 전기영동법으로 분리. 정제하였다. 발견된 lectin은 유럽산과는 당특이성이 다른 ML-II로 밝혀졌으며 두 개의 isofonn, KML-IIU와 KML_IILdp 대한 각종 이화학적 특성과 부분적인 일차구조까지 결정하여 새로운 신물질임을 증명하였음. 비 lectin 단백질성분은 heparin과 반응하는 HBP을 분획하여 일부 생리활성을 조사하였음
2) 비단백질 성분
유기용매와 chromatography 법으로 분리정제하여 얻은 분획중에서 항암활성이 있는 몇 개의 분획을 재정제하여 apoptosis 에 의한 암세포살해능이 있는 흥미있는 몇 개의 물질을 얻었음.
3) Lectin 의 유전자를 cloning
이미 발표된 유럽산과는 전혀 다른 gene 임을 확인하였으며 염기서열에따른 아미노산 서열을 추론하고 이에 근거하여 3차구조를 modeling하였던 바 특히 B-chain은 유럽산의 EML-I의 것과 당결합 부위 Ccarbohydrate binding site) 부분에서 확연히 다른 형 태를 보였다.
2. 한국산 겨우살이 성분들에 대한 항암활성 조사와 주성분 정량을 위한 면역분석법 개발
1) Lectin 성 분들에 대 한 in-vitro 항암효과
먼저 겨우살이 추출물， KM-ll0의 여러 암세포주들에 대한 세포독성효과를 조사하고 여기서 얻은 lectin 함유 분획들(예; KML-AS, KML-C) 을 다시 조사하여 활성을 확인한 후 단일성분으로 분리，정제된 KML-IIU와 KML-IIL의 항암활성을 조사하였을 때 KM-ll0의 활성은 대부분 lectin성분에 의한다는 사실을 확인하였음
2) Lectin 외 성 분들의 항암효과
단백질 성분인 HBP도 KM-ll0수준의 항암효과를 보였으며 특히 비단백성분에서 항암활성을 갖는 몇 개의 흥미있는 물질이 발견되었음
3) In-vivo 항암효과
신생혈관 형성 억제효과， 암전이 억제효과 및 연명율에 미치는 효과등을 조사함으로서 in-vivo항암효과를 조사하였다. 주로 KM-ll0, KML-C, KML-IIU, KML-IIL등을 갖고 조사하였던 바 →강한- 항암효과를 -나타냈다. 이로서 한국산 겨우살이가 나타내는 항암효과는 주로 lectin 성분에 의한다는 in-vitro의 결과를 in-vivo에서도 확인할 수 있었음. 특별히 흥미 있는 결과는 다른 기존 항암제와 병용 투여하였을 시 cisplatin 의 경우 1/5수준까지 낮출 수 있는 상승효과를 나타내었다.
4) 주성분 lectin 정량을 위한 면역분석법 개발
Lectin 에 대한 단일클론 항체를 생산하여 KML-IIU와 specific하게 반응하는 항체를 얻었으며 이를 이용하여 lectin을 ng수준까지 측정 할 수 있는 two-sites sandwich ELISA와 최신 면역분석법의 하나인 TR-FIA를 개발하였다. 개발된 ELISA 법으로 숙주가 다른 겨우살이 추출물 속
에 함유된 lectin함량을 조사，비교한 바 최고 20 배까지 다양한 양을 나타내었다.
3 한국산 겨우살이 주성분의 항암작용 기전 연구
겨우살이의 항암효과는 apoptosis와 같은 직접적인 효과와 다른 면역관련세포들을 자극，활성화 시켜 이들로 하여금 암세포를 공격하는 간접적인 경로 이 두가지 측면에서 조사하였음
1) 암세포에서 apoptosis유도능 및 그 기전 연구
KML-C, KML-IIL 및 KML-IIU 의 세포독성효과는 apoptosis 현상에 의한 것임을 DNA ladder현상조사로 확인하였으며 이는 Ca2/Mg+2-dependent endonuclease에 의한 것임을 확인하였다. 그외 항체의 중화효과， subchain들의 역할， PARP절단효과， western blotting 에 의한 caspase의 활성화 관련 정도등을 조사함으로서 apoptosis현상의 기전까지 일부 규명하였음.
2) 한국산 겨우살이의 면역학적 활성
일반적으로 겨우살이 성분이 갖는 주된 생리활성의 하나는 면역학적 활성이 강하다는 점이다. 이에 본 연구에서는 항원 특이적 및 비특이적 면역증강효과로 구분하여 조사하였다.
(1) 항원 비특이적 면역증강효과
Lectin성분이 기존 mitogen( 예 ;con-A) 과 같이 직접적인 효과는 없었지만 다른 mitogen 의 효과를 상승시키는 효과가 있었고， 특히 대식세포를 자극하여 IL-l, IL-6, r -IFN, TNF-α 와 같은 cytokines을 분비하는 기능이 있었으며 NK-cell활성도 강하게 나타내었다.
(2) 항원 특이적 면역증강효과
항원 KLH 에 대한 항체생산증진효과를 조사함으로서 체액성면역 증진효과를 확인하였던 바 매우 강한 adjuvant효과를 나타내었다.기존의 잘 알려진 FCA adjuvant보다 더 강한 효과를 나타내어 백신용 adjuvant로서의 활용도 기대된다. 이외에 지연성과민(DTH) 반응 및 CTL과 같은 세포성면역증진효과도 있음을 확인하였음
(3) 두 isolectin 의 TNF- α 유도능 조사
순수 분리，정제된 두 lectin성분으로 TNF-a 유도능에 대하여 dose, dexamethasone, pentoxipylene) 의 영 향을 ELISA와 northern blotting 으로 조사하여 져 있지않은 lectin성분의 cytokine유도현상 이해에 기초자료를 제공할 수 있었다.
4. 항암활성을 갖는 한국산 겨우살이 성분들에 대한 에비독성 및 일반약리 시험
항암활성을 갖는 추출물， KM-l1l0 및 단일성분 KML-IIL, KML-IIU에 대한 예비독성시험으로 정맥과 경구 급성독성시험을 통해 치사율을 결정하였고 일반약리시험으로 소화기계，중추신경계 및 혈액응고계에 미치는 영향을 조사하여 전임상후보물질로 사용할 수 있는 가능성이 있음을 확인하였음，
5. 연구성과 및 활용계획
본 과제 수행을 통하여 2건의 국내특허 등록과 국내 2건 특허출원 그리고 미국과 유럽특허 l건 출원준비중인 실재적인 성과를 얻었으며 이에 바탕으로 (주)미슬바이오텍 dlfks 벤처회사를 설립 하였으며 항암제로 개발하기 위해 현재 국내외 유명회사와 추진중에 있음

Abstract ▼

This project has been carried out to develop a new anti -cancer drug from Korean mistletoe based on the previous results showing that Korean mistletoe preparations are more effective than European one. For this, we have tried to isolate and purify the main compounds from the extract(KM-ll0) with ant

This project has been carried out to develop a new anti -cancer drug from Korean mistletoe based on the previous results showing that Korean mistletoe preparations are more effective than European one. For this, we have tried to isolate and purify the main compounds from the extract(KM-ll0) with anti-cancer activity, and characterized their physico- and chemical properties. Anti-tumor acitivities and their mechanism were investigated. And pre-general toxicology and general pharmacology tests were also undert하:en.
1. Discovery of main components having anti-cancer acitivities from Korean mistletoe and characterization
1) Protein components
We have focused on the isolation of lectins by affinity chromatography using specific antibody to lectin. Two isoform lectins such as KML-IIU & KML-IIL were purified and ‘their physico-and chemical properties including partial sequence determenation were investigated. It was proved that Korean mistletoe lectin has different specificity for carbohydrates from European one. Heparin binding protein(HBP) with immunological 없d anti-tumor activity was also fractinated. Several non-protein fraction which might have anti-cancer activity were also obtained.
2) Molecular Cloning of lectin genes from Korean mistletoe
Using a PCR cloning method, both A and B chain genes were cloned with primers designed based upon the partial amino sequence of the lectin. Southem blot analysis data showed that it exists as a multicopy gene or a gene family. 3D-structure modeling was constructed with the amino acid sequence deduced from the data of DNA sequence, which showed that the carbohydrate binding sites is quite different from that of EML=I.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
• Project Summery ... 8
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
• 2. 총괄 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 16
• 3. 총괄.개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 19
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 26
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 31
• 6. 첨부서류 ... 35
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 36
• 1. 제1세부과제 연구개발 과제의 최종연구 개발 목표 ... 37
• 2. 제1세부과제 연구개발의 연구대상 및 방법 ... 37
• 3. 제1세부과제의 최종 연구개발 결과 ... 45
• 4. 제1세부과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 86
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 90
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 92
• 7. 참고문헌 ... 93
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 94
• 1. 제2부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 95
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방볍 ... 95
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 100
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 129
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 131
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 132
• 7. 참고문헌 ... 133
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 134
• 1. 제3부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 135
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 135
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종연구개발결과 ... 139
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 176
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 177
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 178
• 7. 참고문헌 ... 178
• 제4세부연구개발과제 연구결과 ... 179
• 1. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 180
• 2. 제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 180
• 3. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 185
• 4. 제4세부 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 196
• 5. 제4세부 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 197
• 6. 제4세부연구개 발과제의 활용계획 ... 197
• 7. 참고문헌 ... 199
• 끝페이지 ... 199