초록 ▼

IV. 연구개발결과
1. human chorionic gonadotropin 방사면역측정 kit 개발
4종의 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 복수액을 얻은 후，protein Gsepharose 4B Fast Flow Affinity Gel을 이 용하여 복수액 에 있는 항체들을 순수 분리 정제하였다. 이 중 3종의 순수 분리 정제된 단일클론 항체는 SDS-PAGE로 항체의 순도를 조사한 결과 95% 이상으로 확인되었다.
A4W가 ω-hCG에 대한 역가가 가장 높았으며 104 희석배수에서 최대의 반응성을

IV. 연구개발결과
1. human chorionic gonadotropin 방사면역측정 kit 개발
4종의 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 복수액을 얻은 후，protein Gsepharose 4B Fast Flow Affinity Gel을 이 용하여 복수액 에 있는 항체들을 순수 분리 정제하였다. 이 중 3종의 순수 분리 정제된 단일클론 항체는 SDS-PAGE로 항체의 순도를 조사한 결과 95% 이상으로 확인되었다.
A4W가 ω-hCG에 대한 역가가 가장 높았으며 104 희석배수에서 최대의 반응성을 나타냈다. 또한 double immunodiffusion방법 에 의 해 항체 각각의 subtype을 조사한 결과 모두 IgG1 type 인 것으로 조사되었다. hCG의 ß-subunit에만 특이적으로 반응하는 단일 클론 항체인 Alps는 ω-hCG나 α-hCG와의 교차 반응성을 조사한 결과 ω-hCG와는 1.1% 였으며， α → hCG subunit와는 교차 반응성이 없는 것으로 나타났다. C6C 클론의 경우는 Alps와 거의 유사한 결과를 얻었다. 클로라민 -T 법에 의한 항체 표지법으로 각 항체의 표지효율은 A4W 80.7%, C6C89.3%, ALPS 80.4%였고， 요오도젠 법 의 표지 효율은 A4W 68.7%, C6C 72.5%,ALPS 54.7% 였다.
항체를 immobilization하는 방법으로 불용성 고형상에 항체를 결합시키는 고형상법으로 Polystyrene tube 와 bead에 항체의 흡착을 시 행하였다. assay결과 흡착시의 반응온도에 의해서는 영향이 없어으며 3가지 항체중 A4W만이 흡착된 결과를 보였다. 또한 tube와 bead의 흡착정도에는 큰 차이가 없었으나 tube을 사용한 경우가 bead에 비해 배후방사능이 낮게 나타났다.
임산부와 태반에서 hCG를 분리하여， 분리방법에 따라 회수량과 hCG의 차이가있어 계면활성제를 사용한 경우가 가장 높은 농도의 hCG를 분리할 수 있는 방법임을 확인하였으며 따라서 이 방법으로 필요한 hCG를 분리정제하여 표준시료로 이용할 수 있을 것으로 판단된다. 세가지의 hCG에대한 항체를 [¹²⁵]NaI로 표지하여 Biocode사의 hCG kit에 들어있는 coating tube와 여러 농도 표준용액， 두농도의 표준혈청에 대해 assay를 하였다. 측정결과 세 개의 항체중 whole hCG항체인 A4W는 기성의 kit를 사용한 결과에 유사한 결과를 보였으나 beta chain specific hCG항체인 ALPS 와 C6C는 특이적인 결합을 보이지 못했다.융모상피종양 환자 16명 (1 0명의 치료후 추적검사 포함). 자궁외 임신 환자 8 명， 정상 대조군 30명을 대상으로 총 157 예에서 ß-hCG를 측정하였다.
2. 갑상선 thyroglobulin 방사면역측정 kit 개발
human thyrog lobulin 에 반응성을 보이는 우수한 하이 브리 도마 7종(clone 206,clone 46, clone 116, clone 139, clone 87, clone 180, clone 73)을 선별하였다. 이중 c1one 180은 bovine thyroglobulin과도 반응성을 보이는 특이성을 보였다. 단 세포군 항체의 특성 조사에서 단일 클론 항체의 subclass 를 조사한 결과 clone 206, 46, 116 3종은 IgG_2a type, 나머지 4종은 IgG₁ type 인 것으로 판명되었다. 단일 클론 항체의 교차 반응성 조사에서 선별된 7개의 clone 중 clone 180만이 bovine thyroglobulin 에 교차반응성을 보였으며, 나머지 6종의 clone은 bovine thyroglobuin 과 반응하지 않았다. 개발된 7종 중 3종의 하이브리도마 세포조를 마우스의 복강에 주사하여 복수액을 얻은 후, 다량의 순수 항체를 순수 분리 경제하였다. 분리된 항체의 양은 대략 ascites ml 당 2-3mg 의 수율을 보였다.
Chloramin T method 를 이용하여 표지하여 ITLCM로 측정한 결과, 3가지의 anti-Tg antibody 모두 90% 이상의 표지효율을 보였다. I-125 표지항체는 85% methanol에서 origin (Rf=0.0)에 남았으며 표지되지 않은 Free I-125는 front(Rf=1.0)로 올라갔다. 20ug/ml (in 0.02M phosphate buffer, pH 7.4)의 항체를 피복한 유리구슬의 능력을 평가하기 위하여 상품화된 Tg kit 내의 동위원소를 이용하여 면역방사계수법을 실시하였다, total count 에 대한 standard 농도별 bound의 %를 구하여 Tg kit 와 비교하였다. 206, 116 항체는 각각 21.4%, 12.7% 로 비교적 우수한 결합률을 보였으나 139는 0.9%로 저조하였다. 갑상선 환자의 조직액으로부터 sepharose CL-6B column 을 이용하여 thyroglobulin 을 분리하여 HPLC 와 방사면역측정법으로 표준물질을 확보하였다. 116, 206 항체를 ¹²⁵I 으로 방사표지한 결과, 116 항체는 약 0.35mg/ml 이였고 206항체는 약 0.62mg/ml 농도롤 얻을 수 있었다. 이 두항체가 각각 1ug/ml 이 되게 희석하여 제작하였다.
두가지 항체를 IRMA 법의 tracer 로 각각 사용하여 표준물질의 농도가 0-500ng/ml 되는 것을 사용하여 표준곡선을 작성하여 Tg 농도와 비례하여 우수한 직선성을 보였다. 임상검사에서 기존의 kit 와 비교하여 큰 차이가 없었으나 예민도에서 차이를 보여 개선의 여지가 있었다.

Abstract ▼

III. Contents and Results of the Project
1. Development of radioimmunoassay kit for hCG
We developed four hybridomas which could produce the specific monoclonal antibodies to hCG. Positive hybridomas were cloned and ascites fluids were produced by i.p. inoculation of BALB/c mice. From these as

III. Contents and Results of the Project
1. Development of radioimmunoassay kit for hCG
We developed four hybridomas which could produce the specific monoclonal antibodies to hCG. Positive hybridomas were cloned and ascites fluids were produced by i.p. inoculation of BALB/c mice. From these ascites fluid, monoclonal antibodies were purified and antibody characterization was performed. All of these four antibodies were 19G1 subclass. Among these antibodies, A4W antibody showed the highest affinity to whole-hCG.
Meanwhile, Alps antibody was specifically bound to ß -subunit of hCG.
These monoclonal antibodies were labeledwith 1-125 using Chloramin-T method or 1odogen method. The labeling efficiency was 80.7% in A4W antibody, 89.3% in C6C antibody, and Alps in 80.4%, respectively. The Chloamin-T method showed higher labeling efficiency than 1odogen method. The antibodies were fixed to the polysyrene beads or tubes by solid phase
absorption technique. The absorption of antibody to beads or tubes were not varied with reaction temperature‘ HCG, as a standard material for radioimmunoassay, was purified from the urine of pregnant women or placenta. In brief, palcent tissue was dissected and homogenized, and extracted with 1 M sodium chloride. After centrifugation, the supernatant was brought to 0.9M perchloric acid. The extract was analyzed with HPLC system. The concentration of hCH in extract fractions were measure by radioimmunoassay. 1n selected samples we compared the results of a conventional radioimmunoassay (Biocode, Belgium) with our radioimmunoassay system. Among three radioimmunoassay systems, radioimmunoassay system with A4W antibody showed the most reliable and comparable to the commercial hCG kit.
2. Development of radioimmunoassay kit for thyroglobulin
We cloned seven hybridomas(clone 206, clone 46, clone 116, clone 139, clone 87, clone 180, clone 73) which were specifically bound with human thyroglobulin (Tg). The subclass of monoclonal antibodies (206, 46, 116) were IgG2a type and others were IgG 1 type. Ascites fluids were produced by i.p. inoculation of BALB/c mice with four types of hybridomas, repectively and monoclonal antibodies were purified. Three kinds of antibodies (206, 116, 139) were labeled with 1-125 using Chloamin-T method. The labeling efficiency was more than 90%. Solid phase system was developed by the antibody fixation to the polysyrene beads or tubes. With this system, antibody 206 and 116 showed 21.4% and 12.7% of binding rate to thyroglobulin, respectively.
Thyroglobulin was purified from the thyroid tissue fluid with as described previously with minor modification. Clinical feasibility test was performed with our radioimmunoassay system. Standard curve showed good linearity within the range of 0 to 500ng/ml of thyroglobulin concentration. However, the sensitivity of our system was decreased to the commercial kit
system(Diasorin, ltaly). The study to improve the specific activity of 1-125 labeled antibody is mandatory.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구개발 최종보고서 ... 3
• 제출문 ... 4
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 10
• CONTENTS ... 13
• 목 차 ... 14
• 제 1 장 서론 ... 15
• 제 1 절 연구개발의 목적 ... 15
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 15
• 제 3 절 연구개발 범위 ... 17
• 제 2 장 국내·외 기술개발 현황 ... 19
• 제 1 절 국내.외 연구개발 현황 ... 19
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 22
• 제 1 절 연구 배경 ... 22
• 제 2 절 human chorionic gonadotropin 방사면역측정 kit 개발 ... 31
• 제 3 절 갑상선 thyroglobulin 방사면역측정 kit 개발 ... 51
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 86
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 88
• 1. 기대성과 ... 88
• 2. 활용계획 ... 88
• 제 6 장 참고문헌 ... 90
• 최종보고서 요약 (초록) ... 93
• 끝페이지 ... 94