초록 ▼

세균성 이질균에 대한 성분백신 개발을 위하여 선행하여 Shiga toxin B-subunit를 carrier 단백으로 개발하고 쉬겔라 균체로부터 0-specific polysaccharide antigen의 정제방법을 개발하여 단백과 O-specific polysaccharide antigen의 conjugation 방법 개발을 통하여 세균성 이질균의 성분백신을 개발 하고자 한다.
Shiga toxin carrier단백 개발을 위하여 먼저 Shigella 균주가 들어 있는 배양액을 일부 취하여 증류수에 현탁한 후 100℃에서

세균성 이질균에 대한 성분백신 개발을 위하여 선행하여 Shiga toxin B-subunit를 carrier 단백으로 개발하고 쉬겔라 균체로부터 0-specific polysaccharide antigen의 정제방법을 개발하여 단백과 O-specific polysaccharide antigen의 conjugation 방법 개발을 통하여 세균성 이질균의 성분백신을 개발 하고자 한다.
Shiga toxin carrier단백 개발을 위하여 먼저 Shigella 균주가 들어 있는 배양액을 일부 취하여 증류수에 현탁한 후 100℃에서 10분간 끓여 세균 염색체를 용출 시키고 Shiga toxin B subunit 특이적 primer즐 제작하고 이를 바탕으로 PCR 반응을 수행하여 B subunit 유전자를 증폭 시킨다. 그리고 대장균 발현 벡터와 PCR 산물을 제한 효소를 처리하여 절단 시킨 후 agarose gel 전기영동하고 이로부터 DNA 절편들만 순수 분리하여 분리된 PCR 산물과 발현 벡터를 DNA ligase를 이용하여 연결한 뒤 대장균에 형질전환 시켜 형질 전환된 균주로부터 DNA sequencing으로 유전자 염기서열의 정확성을 확인하고 Western blot 분석으로 재조합 단백질의 발현여부를 확인한다.
재조합 Shiga toxin의 대장균 내에서의 대량발현 및 순수분리는 Fermentor를 이용하여 대량배양한 뒤 적당한 inducer를 처리하여 발현을 유도하고 배양된 세균을 원심 분리한 뒤 Sonicator를 이용하여 파괴하고 다시 원심분리하여 재조합 단백질이 함유된 상등액을 취하여 투석을 통하여 완충 용액을 바꾼 뒤 affinity chromatography, ion exchange chromatography 혹은 gel filtration chromatography를 이용 순수 분리 한다.
또한 O-specific polysaccharide 항원의 분리정제를 위하여 Shigella 균주를 최소배지에 접종하여 배양하여 배양액에 Phenol을 처리하여 쉬겔라 균을 불활화 키킨 후 배양액을 원심하여 harvest하고 Heat-phenoI 추출법을 사용하여 균체 수집 액에서 LPS항원을 추출하고 추출액을 에탄올 분획을 실시하여 핵산 및 단백을 제거하고 Diafiltration을 실시하여 탈염을 시킨 후 산을 처리하여 LPS의 lipid A를 분리시킨후 겔여과 컬럼크로마토그라피로 lipid A를 제거하고 0항원을 회수하여 회수한 0항원을 순수에탄올, 아세톤으로 세척하고 진공에서 건조하고 분말로 만든다.
StxB 유전차(Shiga toxin B-subunit) stxB 유전자를 PCR로 증폭하여 pHCE19 series vector, pET24a, pET24d, pGEX4T와 pTYB12에 각각 크로닝하여 StxB 과잉 생산을 위한 조합 플라스미드를 12종 제조하고 이를 여러 종류의 대장균에 도입하였다. StxB 의 signal peptide를 코드하는 염기서열을 제거하였을 때 발현용 벡터에서 StxB 의 생산성이 높은 것으로 확인하였고, 재조합 플라스미드 pET24a-stxB를 함유한 E. coli BL21 (DE3)가 생산하는 StxB 단백질은 전체 단백질의 약 5~10% 정도에 해당하는 것으로 확인되었으며, 60℃에서 30분간 열처리하였을 때 정제도가 약 60% 이상 되는 것으로 나타났다.
그리하여 열처리와 ammonium sulfate 분획, Phenyl-Sepharose column, DEAE column chromatography를 통해 순도 95% 단백질을 회수율이 30%로 얻을 수 있는 StxB의 정제과정을 확립하였다.
최종 정제에서는 S.flexneri 2a인 FOOO1, F0002와 S. sonnei mutant인 M0001이 낮은 수치의단백질 함량과 핵산 함량을 나타내었다. 단백질 함량은 처음 페놀로 LPS추출의 수치에 비해 최종 단계의 정제 수치가 평균 15ug제거됨을 보여주었고, 핵산 함량은 평균 27% 제거됨을 보여주었다.
국내의 Shigella 감염은 1998년 이후 증가세를 보이고 있으며 항생제 내성균이 많이 증가하여 치료보다는 예방의 필요성이 높아지고 있고, 한국은 현재 Shigella 감염에 대해서 안전지대가 아니며 오히려 근래에 발병이 증가하는 추세이므로 우리나라에서 발병하는 균주에 적합한 예방백신의 개발이 필요한 상태이다. Shigella에 대한 성분백신의 주요 성분으로 면역원성을 갖는 O-specific porysaccharide를 분리 정제하였다.
O-SP 정제 항원은 O-SP 항혈청에 대하여 뚜렷한 침강선을 나타내어 면역학적으로 Shigella Flexneri 2a,유래의 오 항원임을 보여주고 있다. 면역력을 높이고 안전한 Carrier 단백질인 shiga toxin을 이용해 성분 백신화 할 예정이다.

Abstract ▼

The objective of experiemnt is to develop conjugate vaccine for shigellosis, composed of the O-specific polysaccharide and shiga toxin B-subunit as a carrier protein.
In order to develop shiga toxin carrier, shigella DNA was amplified with primer designed specific for shiga toxin B subunit. Ampli

The objective of experiemnt is to develop conjugate vaccine for shigellosis, composed of the O-specific polysaccharide and shiga toxin B-subunit as a carrier protein.
In order to develop shiga toxin carrier, shigella DNA was amplified with primer designed specific for shiga toxin B subunit. Amplified products were purified and ligated into expression vector. In transformed E. coli with recombinant DNA vector, nucleotide sequences and expression of recombinant DNA was identified by DNA sequencing and westem blot, respectively. Mass culture of transfonned cell was perfonned by fennentation and expression of recombinant DNA was induced by the treatment of inducer. Purification of recombinant protein as carried out by using several column chromatography including ion exchange, gel filtration and affinity chromatography.
In order to purify O-specific polysaccharide, shigella strains was cultivated in minimal medium and detoxified by phenol treatment. After harvesting detoxified cell, LPS antigen was extracted from cell harvest. Nucleic acid and protein was remoγed from LPS extracts by ethanol fractionation. Further purification .of LPS extracts was carried out by gel column chromatography, which remove lipid A from LPS. Finally purified O-antigan product was washed with organic solvent and vaccum-dried to make powder.
PCR-amplified stxB gene was cloned into several vectors such as pHCE19 series vector, pET24a, pET24d, pGEX4T, and pTYB12. 12 recombinant plasmids for overproduction of stxB subunit were produced and transfonned into several kind of E. coli strains. E. coli BL21 containing PET24a-stxB plasmid produced stxB protein accounting for 5-10% of total protein and purity of STB protein was about 60% after heat treatment. Further purification process such as ammonium sulfate fractionation, column chromatography produced highly purified stxB with 30% yield.
After final purification, both S.flexneri 2a FOOO1, F0002 and S. sonnei mutant showed low amount of protein and nucleic acid. Amount of protein in final product was cut down to 15 ug when compared to phenol extracts of LPS and nuc1eic acid was cut down to 27%. Reaction between purified O-sp antigen and O-sp antiserum demonstrated clear precipitation line. So, this result showed that O-sp antigen was derived from shigella flexeneri 2a strain.
Since increase domestic incidence of shigellosis since 1998 and trends to develop antibiotic-resistant strain was reported, our country is no longer safe place to shigella incidence. Therefore, it is very urgent to develop vaccine for Korean shigella strain.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목 차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 9
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 10
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 11
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 12
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 12
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 13
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 28
• 7. 참고문헌 ... 29
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 30
• 1. 최종연구개발 및 목표 ... 31
• 2. 연구 대상 및 방법 ... 32
• 3. 최종 연구개발 결과 ... 40
• 4. 연구 결과 고찰 및 결론 ... 43
• 5. 참고 문헌 ... 44
• 끝페이지 ... 44