초록 ▼

○ 연구결과
1. 생물검정 및 재배사 실증시험
버섯에서 갈반병을 유발하는 병원균을 버섯재배농가에서 채집한 흙으로부터 분리하고 2개의 균주 P9과 P10은 배색침강선 방법과 형광 분리법에 의해 분리하였다. 2개의 균주 P9과 P10은 느타리버섯 및 팽이버섯에 갈반병을 유도하였으며, 16S rRNAs 염기서열 분석과 tolassin 유전자 분석에서 유전적으로 Pseudomonas tolaasii와 매우 유사하였다. 개량 Bt 656-3 균주의 버섯파리와 갈반병에 대한 살충성 및 항세균성 검정을 실시하였다. 개량형 B. thu

○ 연구결과
1. 생물검정 및 재배사 실증시험
버섯에서 갈반병을 유발하는 병원균을 버섯재배농가에서 채집한 흙으로부터 분리하고 2개의 균주 P9과 P10은 배색침강선 방법과 형광 분리법에 의해 분리하였다. 2개의 균주 P9과 P10은 느타리버섯 및 팽이버섯에 갈반병을 유도하였으며, 16S rRNAs 염기서열 분석과 tolassin 유전자 분석에서 유전적으로 Pseudomonas tolaasii와 매우 유사하였다. 개량 Bt 656-3 균주의 버섯파리와 갈반병에 대한 살충성 및 항세균성 검정을 실시하였다. 개량형 B. thuringiensis 656-3의 제제화를 위하여 독소와 포자를 포함한 침전물을 동결건조 시키고제제를 분무하였을 때, 버섯파리에 대한 살충성과 갈반병에 대한 항세균 활성을 갖는 것으로 나타났다.
2. 버섯파리류 해충 특이 Bt 656-3 균주의 개량
호박벌, Bombus ignitus로부터 4개의 항세균성 유전자 (apidaecin, abaecin, hymenoptaecin, 및 defensin)를 클로닝 하고 발현되는 부위의 특성을 밝혔다. 4개의 항세균성 유전자 중,apidaecin 유전자를 Bt 656-3 균주 개량에 사용하여 항세균성 단백질 BiApid를 발현하는 균주를 제작하여 버섯파리를 포함한 갈반병에도 항세균성을 나타내었다.
버섯파리와 갈반병의 종합적 방제제를 위한 또 하나의 전략으로, Psedomonas tolaasii에 강한 항세균성 활성을 나타내는 Brevibacillus brevis를 pHT1K-1Ac vector로 형질전환 하였다. 형질전환된 B. brevis 3101-3 균주는 B. thuringiensis의 곤충특이 독소 유전자인 cry1Ac 유전자를 안정적으로 발현하였다. 이러한 결과는 항세균성 미생물에 곤충특이적인 독소 유전자를 발현할 수 있는 가능성을제시해 준다.
3. 항세균성 및 살충성 미생물 균주의 탐색, 대량배양 및 제제화
다양하게 채집한 흙 샘플에서 모기유충과 버섯파리에 독성을 갖는 Bacillus thuringiensis DT-5, DT-6, DT-8 및 DT-10 균주를 선별하였다. Bacillus thuringiensis DT-6, DT-8 및 DT-10은 Bt subsp. morrisoni 와 Bt subsp. ostriniae의 H-antiserum과 반응하였으나, B. thuringiensis DT-5는 다른 어떤 H-antiserum과도 반응이 나타나지 않는 새로운 Bt 균주로 사료되었다. 이들중, B. thuringiensis DT-10는 버섯파리에 대한 가장 높은 독성을 보였다. B. thuringiensis DT-10 균주의 플라스미드와 단백질 특성은 subsp. morrisoni PG-14와 비슷하였다.
B. thuringiensis 균주를 개량하기 위하여 pUC ori, multi cloning site 및 resistance gene를 포함한 pHT1K shuttle vector를 제작하였다. pHT1K는 pHT3101 보다 5 - 13배 높은 형질전환율을 보였다. pHT1K vector를 이용하여 cry1Ac 유전자는 약 133 kDa으로 발현되었으며, pHT1K-1Ac의 발현정도는 pProAc와 유사하였다. 이러한 결과는 pHT1K vector는 B. thuringiensis에서 외래 유전자를 발현하는 vector로써 그 장점이 있다.
P. tolaasii에 대하여 항세균성 활성을 보이는 2개의 균주를 분리하고 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 하나는 Brevibacillus brevis로, 나먼지 하나는 Brevibacillus formosus로 나타났다. B. brevis 균주는 B. formosus 보다 갈반병에 대한 강한 활성을 나타내었으며 본 연구에서 갈반병에 대한 미생물 방제제의 하나로 연구되었다.

Abstract ▼

Thus, the objective of the present work was to develop the integrated control agent of insect pest and brown spot against oyster and winter mushroom. There
are three basic strategies of integrated control. These are:
1) Improvement of Bt 656-3 for integrated control of mushroom flies and brow

Thus, the objective of the present work was to develop the integrated control agent of insect pest and brown spot against oyster and winter mushroom. There
are three basic strategies of integrated control. These are:
1) Improvement of Bt 656-3 for integrated control of mushroom flies and brown
spot;
2) Screening, mass-culture of antibacterial and insecticidal microorganisms;
3) Insecticidal and antibacterial effect of B. thuringiensis 656-3 and Brevibacillus
brevis in mushroom house.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 13
• 목차 ... 15
• 제1장 연구개발 과제의 개요 ... 17
• 제1절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 17
• 제2절 연구개발의 내용 및 범위 ... 19
• 제2장 국내·외 기술개발 현황 ... 23
• 제1절 국내·외 관련 기술의 현황과 문제점 ... 23
• 제2절 앞으로 전망 ... 26
• 제3절 기술도입의 타당성 ... 27
• 제3장 연구개발 수행내용 및 결과 ... 28
• 제1절 버섯파리류 해충 특이 Bt 656-3 균주의 개량 ... 28
• 1. 재료 및 방법 ... 28
• 가. 항세균 유전자의 탐색 ... 28
• 나. 재조합 항균단백질의 특성 및 활성 검정 ... 31
• 다. 재조합 Bt 656-3 균주의 제작 ... 33
• 라. 살충성 및 살균성 Bt 656-3 균주의 선발 ... 33
• 마. 개량 Bt 656-3 균주의 제제화 ... 34
• 바. 개량 Bt 656-3 제제의 실증 시험 ... 34
• 사. 재조합 항세균성 미생물 (Brevibacillus brevis) 균주 제작 ... 35
• 2. 결과 및 고찰 ... 36
• 가. 항세균성 유전자 탐색 ... 36
• 나. 재조합 항균단백질의 특성 및 활성 검정 ... 51
• 다. 재조합 Bt 656-3 균주의 제작 ... 54
• 라. 살충성 및 살균성 Bt 656-3 균주의 선발 ... 56
• 마. 재조합 항세균성 미생물 (Brevibacillus brevis) 균주 제작 ... 57
• 제2절 항세균성 및 살충성 미생물 균주의 탐색, 대량배양 및 제제화 ... 60
• 1. 재료 및 방법 ... 60
• 가. 살충성 미생물 균주의 분리 ... 60
• 나. 항세균성 미생물의 선발 ... 61
• 다. 선발 항세균성 및 살충성 미생물의 특성 분석 ... 62
• 라. 선발된 Bt 균주의 살충성 유전자 탐색 ... 64
• 마. Bt - E.coli shuttle vector의 제작과 외래 유전자 발현 ... 66
• 바. 항세균성 미생물의 활성검정 ... 67
• 2. 결과 및 고찰 ... 70
• 가. 살충성 미생물의 분리 ... 70
• 나. 선발된 Bt 균주의 살충성 유전자 탐색 ... 80
• 다. Bt-E.coli Shuttle vector의 제작과 외래 유전자의 발현 ... 83
• 라. 분리된 항세균성 미생물의 특성 분석 ... 87
• 제3절 생물검정 및 재배사 실증시험 ... 92
• 1. 재료 및 방법 ... 92
• 가. 생물검정용 시료 확보 ... 92
• 나. 살충력 및 항균력 검정 ... 94
• 2. 결과 및 고찰 ... 95
• 가. 생물검정용 버섯파리류 해충 (L.mali 및 C. fuscipes) 실내 사육 및 제공 ... 95
• 나. 생물검정용 세균성갈반병 (P. tolaasii) 균주의 배양 및 제공 ... 96
• 다. 살충력 검정 ... 105
• 라. 실증시험 ... 106
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 108
• 제1절 연구개발목표의 달성도 ... 108
• 제2절 관련분야의 기술발전에의 기여도 및 기대효과 ... 109
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 110
• 제6장 참고문헌 ... 111
• 끝페이지 ... 119