초록 ▼

○ 연구결과
1) 새로운 재조합 베큘로바이러스 개발
재조합 베큘로바이러스를 이용한 친환경적인 새로운 바이러스 살충제를 개발하기 위하여,신규 Bt 내독소단백질 유전자 및 재조합 내독소단백질 유전자를 선발하였다. 나비목 해충에 높은 살충성을 가진 Bt K1 및 Bt 2385-1 균주로부터 5종의 새로운 내독소단백질 유전자를 클로닝 하였다. 5종의 신규 내독소단백질은 모두 배추좀나방에 대하여 높은 살충성을 보였으며, 특히 Cry1-1과 Cry1-5는 파밤나방에도 높은 병원성을 보였다.
한편 Bt 내독소단백질과는 다른 살충

○ 연구결과
1) 새로운 재조합 베큘로바이러스 개발
재조합 베큘로바이러스를 이용한 친환경적인 새로운 바이러스 살충제를 개발하기 위하여,신규 Bt 내독소단백질 유전자 및 재조합 내독소단백질 유전자를 선발하였다. 나비목 해충에 높은 살충성을 가진 Bt K1 및 Bt 2385-1 균주로부터 5종의 새로운 내독소단백질 유전자를 클로닝 하였다. 5종의 신규 내독소단백질은 모두 배추좀나방에 대하여 높은 살충성을 보였으며, 특히 Cry1-1과 Cry1-5는 파밤나방에도 높은 병원성을 보였다.
한편 Bt 내독소단백질과는 다른 살충기작을 가지는 신경독소 유전자들인 AvT, PrT 및 AaIT 유전자를 각각 발현하는 재조합 베큘로바이러스, ApAvT, ApPrT 및 ApAaIT를 제작하고 파밤나방에 대한 병원성을 조사한 결과, 전갈 신경독소인 AaIT가 가장 우수한 살충효과를 보였다.
이상의 결과를 바탕으로 배추좀나방과 파밤나방 모두에 높은 살충성을 가지는 새로운 Bt 내독소단백질 Cry1-5와 파밤나방에 우수한 살충력을 보인 전갈 신경독소 AaIT를 동시에 발현하는 새로운 재조합 베큘로바이러스, AcB5B-AaIT를 제작하였다. AcB5B-AaIT의 다각체에는 약 150 kDa의 polyhedrin-Cry1-5-polyhedrin의 융합단백질이 매립되어 있었으며, 이 융합단백질은 누에의 중장소화액에 의하여 약 65 kDa의 내독소단백질로 활성화되었다.
AcB5B-AaIT의 병원성을 배추좀나방과 파밤나방 유충에 대하여 조사한 결과, 배추좀나방에 대해서는 Cry1Ac만을 발현하는 Ap1Ac에 비해 2배 정도 감소한 LT5 0 값을 보였으며,파밤나방에 대해서는 Cry1C만을 발현하는 Ap1C에 비해 약 4배 정도의 섭식거부 효과를 보였다. 이러한 결과는 AcB5B-AaIT가 좁은 숙주 범위와 지효성의 단점을 극복할 수 있는 미생물살충제로 유용하게 이용될 수 있음을 보여주었다.
또한, AcB5B-AaIT는 계대배양이 거듭될수록 다각체에 포함된 내독소단백질의 융합단백질이 점점 감소하고 궁극적으로는 야생주 베큘로바이러스로 전환됨으로써, GMO가 가지고 있는 환경에의 위해성을 제거할 수 있는 새로운 유전자조작 바이러스 살충제로서의 유용성을 확인하였다.
2) 곤충ㆍ거미 유래 살충성 유전자 선발
P. rufa, B. ignitus 및 A. ventricosus로부터 cDNA 유전자은행을 제작하고 무작위로 선별한 cDNA 염기서열 결정하였다. P. rufa의 경우에는 모두 54개 그리고 A. ventricosus의 경우에는 385개의 클론에서 발현 유전자 꼬리표 (ESTs)를 생산할 수 있었다. P. rufa로부터 PrSP를, B. ignitus로부터 BiLP 및 BiVP 유전자를, 그리고 A. ventricosus로부터 AvTox1, AvTox2를 선발하였다.
P. rufa로부터 찾은 PrSP 유전자는 총 1,474 bp이고 257개의 아미노산으로 구성되어 있었으며, 3개의 exon과 2개의 intron을 가졌다. PrSP 유전자는 single copy로 존재하였으며, 중장 조직 특이적으로 합성되어 섭취물을 소화시키는 역할을 하는 것으로 추측되었다.
호박벌 B. ignitus로부터 새로운 독샘 특이적으로 발현되는 lipase 유전자를 확보하였다.
BiLP 유전자는 954 bp이고 317개 아미노산으로 이루어져 있는데, lipase 유전자에서 특이적으로 보이는 촉매영역인 GXSXG 잔지를 확인할 수 있었다. BiLP 유전자의 예상되는 아미노산 서열과 기존에 보고된 lipase와 비교했을 때, 곤충 lipase와 높은 상동성을 가졌다.
BiLP는 여왕벌과 암벌의 지방체에서만 발현되었고 이는 지방체에서 발현되어 독샘으로 분비되리라 추정되었다.
BiVP는 1,080 bp이고 360개의 아미노산으로 구성되어 있었으며, Apis mellifera의 venom protease와 61%의 높은 상동성을 보였다. BiVP는 촉매영역과 14개의 cysteine 잔기가 잘 보존되어 있었고, 여왕벌과 암벌의 지방체에서만 발현이 일어났으며 수벌에서는 발현이 되지않았다.
A. ventricosus로부터 클로닝된 독소 유전자, AvTox1은 240 bp, 80개 아미노산을 가지고, AvTox2는 192 bp이고 64개의 아미노산으로 이루어져 있었다. AvTox1 유전자는 뱀, Anemonia sulcata의 독과 AvTox2는 전갈인, Centruroides limpidus limpidus의 독과 상동성을 나타내었다.
위에서 선발된 살충성 유전자, PrSP, AvTox1 및 AvTox2를 베큘로바이러스에 삽입하여 재조합 베큘로바이러스를 제작하고 파밤나방 유충을 대상으로 생물검정을 실시한 결과, 재조합 베큘로바이러스 AcNPV-PrSP는 LT50 값이 130.72 시간, AcNPV-AvTox1은 LT50 값이 124.53 시간 그리고 AcNPV-AvTox2는 LT50 값이 125.72 시간으로 wild-type AcNPV의 LT50 값 143.72 시간 보다 단축되었다.
3) 새로운 재조합 베큘로바이러스의 대량생산 체계 확립 및 제제화
곤충세포를 이용한 재조합 베큘로바이러스 대량생산 체계를 확립하기 위하여 세포 생육 및 바이러스 생산성 높은 High-Five 곤충세포를 선발하였으며 적합한 생산조건을 확립하였으며, 소규모 Bioreactor 조건에서 세포생육 및 바이러스 생산성을 높이기 위해 배양액 유동방식을 변경(paddle type->marine type)하여 생산효율을 높였다. 기존 생산 배지의 경제성을 높이기 위해 저가용 인공배지 검토를 진행하여 26세대까지 계대를 유지하였으나 지속적인 활력유지가 어렵고 바이러스 생산성이 낮았다. 또한, 곤충세포를 이용한 생산방법은 장기간의 배양기간, 생산 효율성 및 경제성 부족으로 미생물 살충제의 원료 생산으로는 부적합한 것으로 판단되었다.
곤충유충을 이용한 재조합 베큘로바이러스 대량생산의 경우 파밤나방 대량사육을 위한 환경 및 시설조건과 경제성 있는 배지를 선발하였다. 파밤나방 유충을 이용한 대량생산 조건은 인공사료 (diet Ⅰ)에서 사육된 3령 유충을 이용하여 바이러스 접종액 (1×103 PIBs/㎖)을 인공사료에 분무처리 한 후 25-27℃ 조건에서 7일 내외로 바이러스의 생산을 유도한 후 사체를 수거하여 세척 및 동결건조를 진행하여 최종 미생물농약 원제분말을 확보하였으며, 생산성 향상을 위해 Boric acid (1-2%)를 접종액에 첨가하였다. 이는 곤충세포를 이용하는 방법에 비해 생산성과 경제성이 높은 것으로 판단되었다.
재조합 베큘로바이러스 제제의 물리성 및 제제 안정성을 검토하여 최적 수화제 및 액상수화제 처방을 확립하였으며, 특히 액상제형에서는 제제 pH와 원제 분말 건조방법보다는 원제의 후처리공정 (세척)이 제제의 경시안정성과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다.
최종적으로 처방된 제제의 살충효과를 검정한 결과, Bt 독소 유전자가 함유된 재조합 베큘로바이러스는 실내조건에서 야생주 바이러스가 갖는 target인 파밤나방뿐만 아니라 배추좀나방과 목화바둑명나방에도 높은 살충력을 보였으며, 거세미나방에는 낮은 효과를 보였다. 포장조건에서 최적화된 수화제와 액상수화제를 분무살포한 결과 배추좀나방과 파밤나방에 80-90%의 실용성 있는 살충효과를 확인하였다.
야외조건에서의 안정성을 검정한 결과, 재조합 베큘로바이러스는 야외조건에서 분무살포된지 10일 이후부터 활성감소가 관찰되어 해충의 밀도증감 및 유입상황에 따라 활성 유지측면에서 7-10일 간격으로 반복 처리하는 것이 효과적일 것으로 판단되었다.

Abstract ▼

To develop novel viral insecticides using recombinant baculovirus enabling environment-safe control of economic lepidopteran pests, novel crystal protein genes and recombinant crystal protein genes of Bacillus thuringiensis were screened. Crystal protein gene profiles of B. thiringiensis K1 and B. t

To develop novel viral insecticides using recombinant baculovirus enabling environment-safe control of economic lepidopteran pests, novel crystal protein genes and recombinant crystal protein genes of Bacillus thuringiensis were screened. Crystal protein gene profiles of B. thiringiensis K1 and B. thuringiensis 2385-1 which were highly toxic to lepidopteran insects and predicted to contain various novel crystal protein genes were investigated using PCR-RFLP analysis. Five novel crystal protein genes were cloned from these two B. thuringiensis isolates, and their insecticidal activities were estimated using recombinant baculoviruses expressing corresponding novel crystal protein. All of five novel genes showed high toxicities against Plutella xylostella larvae. In addition, two genes, cry1-1 and cry1-5, showed high level of insecticidal activities against Spodoptera exigua larvae.
For the expression of recombinant crystal protein of Cry1Ac and Cry1C, recombinant baculovirus, ApPAC-F, expressing Cry1Ac-EGFP-Cry1C fusion protein were constructed. About 190 kDa of Cry1Ac-EGFP-Cry1C fusion protein expressed by ApPAC-F was occluded into the polyhedra produced by the recombinant virus, and activated as 65 kDa of crystal protein when treated with gut-juice of Bombyx mori. The insecticidal activity of ApPAC-F against P. xylostella larvae was about 1.7 fold higher than that of recombinant virus, Ap1AC expressing Cry1Ac. Also, S. exigua larvae fed the recombinant polyhedra of ApPAC-F refused to consume the contaminated diets.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 13
• 목차 ... 14
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 18
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 중요성 ... 18
• 1. 연구개발의 배경 및 목적 ... 18
• 2. 연구개발의 필요성 ... 19
• 가. 기술적 측면 ... 19
• 나. 경제ㆍ산업적 측면 ... 20
• 다. 사회ㆍ문화적 측면 ... 21
• 제 2 절 연구개발의 내용 및 범위 ... 22
• 1. 연구개발의 목표와 내용 ... 22
• 2. 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 23
• 3. 연구추진 내용 및 계획 ... 26
• 가. 연구추진 전략 ... 26
• 나. 연구개발 내용 ... 27
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 30
• 제 1 절 국내 기술현황 ... 30
• 제 2 절 국외 기술현황 ... 31
• 제 3 절 기술개발의 파급효과 및 금후의 전망 ... 32
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 34
• 제 1 절 새로운 재조합 베큘로바이러스 개발 ... 34
• 1. 재료 및 방법 ... 34
• 가. 새로운 Bt 내독소단백질 유전자의 확보 ... 34
• 나. 새로운 Bt 내독소단백질 재조합 유전자의 제작 ... 36
• 다. 거미, 반딧불이 및 전갈 유래 살충성 유전자의 선발 ... 44
• 라. 살충성 Bt유전자와 신경 살충성 유전자를 발현하는 재조합 바이러스, AcB5B-AaIT의 제작 ... 45
• 2. 결과 및 고찰 ... 48
• 가. 새로운 Bt 내독소단백질 유전자의 확보 ... 48
• 나. 새로운 Bt 내독소단백질 재조합 유전자의 제작 ... 51
• 다. 거미, 반딧불이 및 전갈 유래 살충성 유전자의 선발 ... 56
• 라. 살충성 Bt 유전자와 신경 살충성 유전자를 발현하는 재조합 바이러스, AcB5B-AaIT의 제작 및 특성 검정 ... 60
• 3. 결론 ... 72
• 제 2 절 곤충ㆍ거미 유래 살충성 유전자 선발 ... 75
• 1. 재료 및 방법 ... 75
• 가. 곤충(반딧불이 유충과 호박벌) 및 거미류 시료 채집 ... 75
• 나. 늦반딧불이, 호박벌, 거미등의 cDNA 유전자은행 제작 ... 75
• 다. cDNA 유전자은행 탐색을 통한 살충성 유전자 확보 ... 76
• 라. 곤충유래 살충성 독소가 포함된 다각체를 생산하는 베큘로바이러스 제작 ... 77
• 마. 독소 유전자들의 특성 분석 ... 79
• 바. 새로운 재조합 베큘로바이러스의 목적해충에 대한 생물검정 ... 82
• 사. 살충제로의 이용가능성 분석 ... 82
• 2. 결과 및 고찰 ... 83
• 가. 늦반딧불이, 호박벌, 거미등의 cDNA 유전자은행 제작 ... 83
• 나. cDNA 유전자은행 탐색을 통한 살충성 유전자 확보 ... 83
• 다. 곤충유래 살충성 독소가 포함된 다각체를 생산하는 베큘로바이러스 제작 ... 99
• 라. 독소 유전자들의 특성 분석 ... 101
• 마. 재조합 베큘로바이러스의 목적해충에 대한 생물검정 및 살충제로의 이용가능성 분석 ... 116
• 3. 결론 ... 124
• 제 3 절 새로운 재조합 베큘로바이러스의 대량생산 체계 확립 및 제제화 ... 126
• 1. 재료 및 방법 ... 126
• 가. 곤충 세포를 이용한 재조합 베큘로바이러스 대량생산 연구 ... 126
• 나. 곤충 유충을 이용한 재조합 베큘로바이러스 대량생산 연구 ... 133
• 다. 실내조건에서의 재조합 베큘로바이러스의 살충효과 검정 ... 138
• 라. 제형화 연구 ... 142
• 마. 최적화된 제제품의 야외조건에서의 실증연구 ... 143
• 2. 결과 및 고찰 ... 145
• 가. 곤충 세포를 이용한 재조합 베큘로바이러스 대량생산 연구 ... 145
• 나. 곤충 유충을 이용한 재조합 베큘로바이러스 대량생산 연구 ... 162
• 다. 실내조건에서의 재조합 베큘로바이러스의 살충효과 검정 ... 174
• 라. 제형화 연구 ... 183
• 마. 최적화된 제제품의 야외조건에서의 실증연구 ... 193
• 3. 결론 ... 196
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 199
• 제 1 절 연구개발 목표와 평가의 착안점 ... 199
• 1. 연구개발 목표 ... 199
• 2. 연구평가의 착안점 ... 199
• 제 2 절 연구개발목표의 달성도 ... 201
• 1. 새로운 재조합 베큘로바이러스 개발 ... 201
• 2. 곤충ㆍ거미 유래 살충성 유전자 선발 ... 202
• 3. 새로운 재조합 베큘로바이러스의 대량생산 체계 확립 및 제제화 ... 203
• 제 3 절 연구개발의 관련분야 기여도 ... 205
• 1. 기술적 측면 ... 205
• 2. 경제ㆍ산업적 측면 ... 205
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 207
• 제 6 장 참고문헌 ... 208
• 끝페이지 ... 214