초록 ▼

Ⅳ. 연구 개발 결과
1. DNA chip을 위한 microarrayer와 scanning system의 개발
DNA chip제작을 위한 microarrayer, scanner, analyzer는 기존의 분자 생물학적 지식에 바탕을 두고 최첨단의 기계공학 및 전자공학의 기술을 접목해서 만들어 낸 것이다. 기계의 자동화와 전자 제어 기술 등을 이용하여 적게는 수천 개부터 많게는 수십만 개의 DNA를 아주 작은 공간에 집적시킨 것을 DNA chip이라고 하며, 본 연구에서는 DNA chip을 제작하고 분석하기 위한 통합툴로서

Ⅳ. 연구 개발 결과
1. DNA chip을 위한 microarrayer와 scanning system의 개발
DNA chip제작을 위한 microarrayer, scanner, analyzer는 기존의 분자 생물학적 지식에 바탕을 두고 최첨단의 기계공학 및 전자공학의 기술을 접목해서 만들어 낸 것이다. 기계의 자동화와 전자 제어 기술 등을 이용하여 적게는 수천 개부터 많게는 수십만 개의 DNA를 아주 작은 공간에 집적시킨 것을 DNA chip이라고 하며, 본 연구에서는 DNA chip을 제작하고 분석하기 위한 통합툴로서 microarrayer, scanner, analyzer의 제작 및 위한 하드웨어 및 소프트웨어의 개발 결과를 기술하였다.
먼저, 개발된 microarrayer 시스템은 정밀 가공된 Tip과 Tip holder,스테핑 모터 그리고 microcontroller를 이용하여 3축 직교로봇을 제어할 수 있도록 개발하였다. 더불어서 DNA chip을 제작하기 위하여 반드시 요구되는 요소라고 할 수 있는 clean station 및 base plate도 설계 및 제작하였다.
개발된 microarrayer 시스템은 관련 문헌과 제품을 생산하는 관련 기업을 통한 연구정보를 통하여 저가형 제품개발을 위한 적정조건을 고려하였고, 본 연구에서 개발된 microarrayer 시스템의 실험결과를 통하여 1㎠안에 192개의 oligonucleotide을 찍을 수 있는 저집적 DNA chip 제작용microarrayer를 개발할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 DNA chip microarrayer 시스템은 중소 규모의 연구소를 포함한 국내 대학연구실에서 실험목적으로 사용하기에는 상당히 유용한 시스템임을 확인할 수 있었다.
다음으로 본 연구의 scanner 시스템에서는 기존의 Southern blot나 Northern blot보다 다수의 DNA를 분석할 수 있는 시스템을 개발하였다.
본 연구에서 scanner 시스템의 특징은 유전 물질을 심는 매체를 nitrocellulose 막 대신에 일반적인 슬라이드 글라스를 사용하여 DNA chip 위에 대상 생물로부터 추출한 RNA를 hybridiztion시키고 cDNA와RNA의 상보성에 따라서 강도가 다른 형광을 얻는다. 이렇게 다른 형광성을 가진 DNA chip을 confocal laser scanner와 같은 화상 획득 장치를 이용하여 컴퓨터에서 읽은 뒤, 화상 해석 소프트웨어인 analyzer를 이용해서 그 유전자형을 동정할 수 있게 하였다. 또한 개발 DNA chip scanner 시스템을 실제 생명공학 관련 연구 분야에 직접 적용한 실험결과를 통하여 개발 시스템의 유효성을 검증하였다.
Analyzer에서는 scanner를 통해 얻은 영상에 대한 처리 알고리즘을 제시한다. 본 프로그램은 영상처리와 마이크로컨트롤러기술, PC응용기술을 이용하여 다수의 물체를 계측하는 실시간 무인자동화 시스템으로서 DNA chip scanner 시스템을 활용하기 위한 영상처리 알고리즘의 유효성을 제안하고 검증한 연구결과이다.
본 연구에서, 우리는 다수의 물체들을 동시에 검출하고 제어하기 위한 영상처리 알고리즘을 개발함으로서, 실제 실험결과를 통하여 약 0.12mm의 정밀도를 구현을 하였으며 화면상에 나타나는 관측점의 픽셀 면적을 크게 할수록 정밀하다는 것을 확인할 수 있었다. 더구나 이러한 영상처리 알고리즘은 DNA chip scanner 개발에서 가장 중요한 요소라고 할 수 있는 영상처리 부분에 적용한 결과로 알고리즘의 유효성을 검증할 수 있었다.
2. DNA chip의 제작 및 제반 조건 구축
감염된 어류로부터 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 진단용 DNA chip의 제작을 위한 최적 조건을 조사하였다. 이를 위해 rhabdoviridae, Birnaviridae, iridoviridae, baculoviridae, 그리고 parvo-like virus를 대상바이러스로 채택하였고, 각 바이러스의 단백질의 염기서열을 분석하여 specific probe를 선정한 다음, 이를 GenBank를 이용하여 분석하였다. 각 probe는 특이 primer로 PCR을 실시하였고, NCBI의 blast alignment를 통해 특이성을 확인하였다.
또한 target DNA는 바이러스가 감염된 cell line으로부터 total RNA를 분리하여 reverse transcription에 의해 Cy5가 결합된 cDNA를 제작함으로써 준비되었다. 선정된 probe를 자체 개발된 Genomics microarrayer를 이용하여 slide glass에 spotting 한 다음, probe와 target DNA를 hybridization 시킨 후 스캐닝을 실시하였다. 이 때, spotting에 필요한 microarrayer chamber 내의 습도, 사용된 슬라이드 글라스의 종류, total RNA 농도 그리고 hybridization 온도 등의 최적 조건을 검토하였다.
그 결과 poly-L-lysine과 aminosilane이 코팅된 슬라이드 글라스에서 효과적인 결과를 얻을 수 있었으며, spotting에 필요한 Genomics microarrayer chamber 내의 습도는 두 슬라이드 글라스 모두 60-65% 로 선정되었다. 또한 hybridization 온도는 poly-L-lysine의 경우 65℃,aminosilane 슬라이드 글라스의 경우 62℃에서 정확한 결과를 얻을 수 있었다. Target DNA의 제작에 필요한 total RNA의 농도는 aminosilane이 코팅된 슬라이드 글라스의 경우 IHNV가 100 ㎍, VHSV는 60 ㎍ 그리고 HIRRV는 50 ㎍이 최적인 것으로 나타났으며 poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드 글라스의 경우는 IHNV와 VHSV, HIRRV의 각각 80 ㎍, 50 ㎍,50 ㎍에서 결과를 나타내어 total RNA의 농도는 50 ㎍이상 필요한 것으로 사료되었다.
cDNA chip의 효과를 검증하기 위하여, 실제 바이러스에 감염된 어체로 부터 분리한 total RNA를 이용하여 제작된 target DNA로 바이러스 검출을 실험하였을 때, VHSV와 IHNV의 구조단백질에 관련된 gene이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
3. DNA chip의 현장에의 적용
Poly-L-lysine이 코팅된 slide glass를 기본 slide glass로 하여 대상 바이러스의 22개 specific probe를 모두 하나의 slide glass에 spotting하여 어류 질병 바이러스 진단용 DNA chip을 제작하였다. 이렇게 제작된 chip을 현장 적용에 앞서 효율을 검증하기 위하여 cell line에 VHSV,HIRRV, 그리고 IHNV를 접종하여 배양 한 뒤, total RNA를 추출하여 적용하여 보았다. 그 결과 VHSV, HIRRV, 그리고 IHNV의 모든 spot에서 정확한 signal을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 β-actin에서도 정확한 signal을 나타내어 진단용 chip으로서 바이러스 특이성과 효율성을 검증하였다. 이렇게 검증된 DNA chip으로 실제 현장에 적용하고자 하였다. 먼저 외부적으로 병리 증상을 나타내는 증상어에서 추출한 total RNA로 실험한 결과 IHNV를 비롯한 7가지 바이러스 종을 모두 검출해 낼 수 있었으며, 또한 병리 증상을 나타내지 않는 무증상어에서도 VHSV, FLDV,IHNV, HIRRV, 그리고 SVCV 등 여러 가지 바이러스종을 진단해 낼 수 있었다. 한편 바이러스 한 종 뿐만아니라 2가지 이상의 바이러스가 감염된 어류로 실험한 결과 감염된 바이러스종을 모두 검출해 낼 수 있었다. 이를 통해 DNA chip의 장점인 여러 유전자의 동시진단이 가능하고, 빠르고 정확하게 진단해 낼 수 있는 것으로 사료되었다.

Abstract ▼

1. Development of microarrayer and ccanning systems for DNA chip
Microarrayer, scanner and analyzer for manufacturing DNA chip are made by jointing mechanics and electronics that are based on knowledge of molecular biology. It is DNA chip that is accumulated from thousands to hundreds of thousand

1. Development of microarrayer and ccanning systems for DNA chip
Microarrayer, scanner and analyzer for manufacturing DNA chip are made by jointing mechanics and electronics that are based on knowledge of molecular biology. It is DNA chip that is accumulated from thousands to hundreds of thousands of DNA to very small space. And this research described development result of hardware and software for producing of microarrayer, scanner, analyzer as integration tool to make and analyze DNA chip.
First, developed microarrayer system was made to be able to control by using microcontroller treated accurately Tip and Tip holder, stepping motor, and 3 axises cartesian robot. And clean station and base plate are requisite element of making DNA chip was designed and manufactured. Developed microarrayer system was considered optimum condition for low-cost style product of development through research information of corporation that have produced literature and product. The microarrayer for accumulation DNA chip manufacture could be developed that can imprint 192 oligonucleotide in 1㎠ through experiment result of microarrayer system in this research.
Second, system is developed that can analyze many DNA than existent Southern blot or Northern blot in scanner system of this research. The characteristic of scanner system is that gets other fluorescence according to complementariness of cDNA and RNA, after hybridizing on DNA chip extracted RNA from target creature. Then, capturing heredity material use just general slide glass instead of nitrocellulose in this research. After reading DNA chip that have other fluorescent pigment in computer using image acquisition device such as confocal laser scanner, the gene can be identified the genotype using analyzer that is image analysis software. Also, effectiveness of development system is verified through experiment result that apply developed DNA chip scanner system directly in actuality life science research field.
Third, in Analyzer chapter, we suggest processing algorithm for picture that get through scanner. This program is result that propose and verifies effectiveness of image processing algorithm to utilize DNA chip scanner system as real time soldier automation system that measure many body by using technilogy of image processing, microcontroller, and PC application In this research, we did that detect many bodies at the same time and develop image processing algorithm to control. So, we could confirm that is the greater pixel area of observation point, the detailer on screen accuracy, and could embody accuracy of 0.12mm through actuality experiment result.
Furthermore, these image processing algorithm could be verified effectiveness of algorithm by result that apply on image processing part that can speak that is the most important urea in DNA chip scanner.
2. Construction of optimum conditions for preparation of diagnostic fish rhabdovirus DNA chip
For rapid and accurate detection of fish viral disease from infected fish, DNA chip technology, which can search for various and specific gene, was applied.
Five families involving rhabdoviridae, Birnaviridae, iridoviridae, baculoviridae, and parvo-like virus were selected as objective viruses.
Sequences for probes were determined by sequence analysis of structural proteins of each virus which have been published on GenBank. Probes were prepared by Polymerase Chain Reaction (PCR) with each of specific primer set.
The specificity of probes were identified by blast alignment in NCBI, and the homologies are above 95%. Prepared probes were spotted on the amine and poly-L-lysine coated slide glass using self-developed microarrayer system.
Target DNA were obtained from total RNA of virus-infected cell lines by reverse transcription. During reverse transcription, target DNA (cDNA) were labelled with fluorescent dye (Cy5-dUTP). The hybridization conditions such as target DNA concentration, hybridization temperature and kind of slide glass were investigated.
Two kinds of slide glasses, which were coated with poly-L-lysine and aminosilane, were tested for probe spotting. Target DNA, which were prepared from virus-infected cell lines, showed hybridization signal on the both of slide glasses. In this experiment used probe concentration 200 ng/㎕. Humidity condition for spotting was investigated with poly-L-lysine slide glass, 65- 65% of humidity was considered to effective for probe spotting. The hybridization temperature of poly-L-lysine and aminosilane coated slide glass were respectively 65℃ and 62℃. Total RNA concentration for poly-L-lysine coated slide glass was adjusted 80 ㎍, 50 ㎍ and 50 ㎍ in accordance with IHNV, VHSV and HIRRV. While, its concentration was 100 ㎍, 60 ㎍ and 50 ㎍ in the case of aminosilane coated slide glass.
It was tested the in vivo detection ability of cDNA chip using virus-infected fishes, olive flounder and rainbow trout. The results showed the successful detection of IHNV and VHSV gene in the virus-infected fishes.
3. Application of DNA chip in field
Based on the slide glass of poly-L-lysine, trials for detection exploring of fish were zccomplish by fish viral disease DNA chip. For the successful DNA chip hybridization, all procedure was optimized step by step including probe preparation, fabrication of DNA chip, hybridization condition, and washing conditions. It was tested the in viro detection ability of DNA chip using VHSV, HIRRV and IHNV. This results shows the DNA chip was certificated as tools which diagnostic fish viral DNA chip, because appeared signals were specific and right.
In first, we have detected 7 virus strains including IHNV from fish which expose the pathogenic symptoms. Also it was deected VHSV, FLDV, IHNV, HIRRV and SVCV in fish which was not reveal the symptoms. In addition to, Virus of 2 strain were detected simultaneously from a infected fish. It was possible that many viruses were detected by one experiment at th same time,

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 11
• CONTENTS ... 15
• 목차 ... 18
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 21
• 제 1 절 연구 개발 과제의 목적 ... 21
• 제 2 절 연구 개발 과제의 필요성 ... 22
• 1. 기술적 측면 ... 22
• 2. 경제ㆍ산업적 측면 ... 25
• 3. 사회ㆍ문화적 측면 ... 26
• 제 3 절 연구 개발 과제의 범위 ... 27
• 제 2장 국내ㆍ외 기술 개발 현황 ... 29
• 제1절 국내ㆍ외 기술 개발 현황과 문제점 ... 29
• 1. 어류 바이러스의 진단 방법 (국내ㆍ외) ... 29
• 2. 국내 DNA chip 연구의 현황 ... 29
• 3. 국외 DNA chip 연구의 현황 ... 30
• 제 2 절 앞으로의 전망 ... 31
• 1. 바이러스의 신속 진단법 도입 ... 31
• 2. DNA chip 시장의 확대 ... 31
• 3. 기술 도입 의 타당성 ... 32
• 4. 추진 전략 및 방법 ... 33
• 제 3 장 연구 개발 수행 내용 및 결과 ... 35
• 제 1 절 저가형 microarrayer의 개발 ... 35
• 1. 연구 재료 및 방법 ... 35
• 2. 연구 결과 ... 41
• 3. 실험 및 검증 ... 61
• 제 2 절 DNA chip용 Scanner의 개발 ... 77
• 1. 연구 재료 및 방법 ... 77
• 2. 연구 결과 및 고찰 ... 80
• 제 3 절 저/고집적 DNA chip의 동정알고리즘 및 소프트웨어 개발 ... 107
• 1. 연구 재료 및 방법 ... 107
• 2. 연구 결과 및 고찰 ... 130
• 3. 실험 및 검증 ... 136
• 제 4 절 어류 질병 바이러스의 유전자 분석 및 probe 제작 ... 147
• 1. 연구 재료 및 방법 ... 147
• 2. 연구 결과 및 고찰 ... 155
• 제 5 절 어류 질병 바이러스 DNA chip의 제작 및 제반 조건 구축 ... 168
• 1. 연구 재료 및 방법 ... 168
• 2. 연구 결과 및 고찰 ... 173
• 제 6 절 양식장에의 DNA chip 진단법의 적용 ... 196
• 1. 연구 재료 및 방법 ... 196
• 2. 연구 결과 및 고찰 ... 199
• 제 4 장 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 211
• 1. DNA Chip용 Microarayer개발 ... 211
• 2. DNA Chip용 Scanner의 개발 ... 211
• 3. 저/고집적 DNA Chip의 동정알고리즘 및 소프트웨어 개발 ... 212
• 4. DNA Chip 및 Microarryer/ Scanner의 상품화 ... 213
• 5. 국내 어병 바이러스 연구 가속화 ... 214
• 6. 국내 유전자 분석 연구의 가속화 및 선진화 ... 214
• 7. DNA chip 기술의 국제 경쟁력 확보 ... 215
• 8. 어병 바이러스 진단의 새로운 패러다임 제시 ... 215
• 9. 수산물의 안정적 생산 및 바이러스 검역의 가속화 ... 216
• 10. 유전자형 동정 기술을 포함한 DNA chip 관련 제반 기술의 국산화 ... 216
• 제 5 장 연구 개발 결과의 활용 계획 ... 218
• 1. 기존의 검사법을 대치 ... 218
• 2. 국립수산과학원 및 산하 기관과 관련업계에 보급 ... 218
• 3. 타 양식 생물로의 적용 확대 ... 218
• 제 6 장 참고문헌 ... 219
• 끝페이지 ... 226