초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구 개발 결과
가. 이유자돈 전신성 소모성 증후군 병인론 및 질환 모델 개발
이유자돈 전신성 소모성 증후군의 주요 원인체인 돼지 써코바이러스 2형을 이유자돈 전신성 소모성 증후군에 감염된 돼지로부터 돼지 써코바이러스에 감염되어 있지 않은 PK-15 cell line을 이용하여 분리(SNUV000463). 증식(1.2 x 10⁵ TCID₅₀/ml)하였으며, 돼지 써코바이러스 2형이 이유자돈 전신성 소모성 증후군을 유발하는데 중요한

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구 개발 결과
가. 이유자돈 전신성 소모성 증후군 병인론 및 질환 모델 개발
이유자돈 전신성 소모성 증후군의 주요 원인체인 돼지 써코바이러스 2형을 이유자돈 전신성 소모성 증후군에 감염된 돼지로부터 돼지 써코바이러스에 감염되어 있지 않은 PK-15 cell line을 이용하여 분리(SNUV000463). 증식(1.2 x 10⁵ TCID₅₀/ml)하였으며, 돼지 써코바이러스 2형이 이유자돈 전신성 소모성 증후군을 유발하는데 중요한 역할을 담당하는 돼지 파보바이러스를 Swine testicle (ST) cell line을 이용하여 분리
(SNUV000464), 증식(1.3x 10⁵ TCID₅₀/ml) 하였다. 이들 국내에서 분리한 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스를 이용하여 4주령 돼지에 공격접종 실험하였다.
접종 후 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스 2형을 혼합 접종한 군에서 심한 위축, 기침, 설사, 황달 등 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 임상증상을 보였으며 5주후 부검 및 조직병리학적 검사결과 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 전형적인 육아종성병변 및 세포질내 포도송이 모양의 세포질내 봉입체를 관찰할 수 있었다. 반면에 돼지 써코바이러스 2형만을 단독으로 접종한 군에서는 임상증상이나 병변의 정도가 모두 혼합접종군에 비하여 경미하였으며, 파보바이러스 단독 접종군과 바이러스를 접종하지 않은 군에서는 병변이 관찰되지 않았다.
접종 실험을 통하여 얻은 조직으로부터 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 파보바이러스에 대한 조직내교잡법을 수행한 결과 감염 일령이 증가 할수록 바이러스에 감염된 세포의 수가 급격히 증가 하는 것을 알 수 있었으며 감염부위는 폐, 간, 심장, 비장, 소장, 림프절, 편도선 등 주요 장기에서 거의 모두 감염이 이루어 지고 있었다. 만성염증의 주요 유발 물질이자 병변 형성에 관여하는 싸이토카인인 TNF-α와 케모카인인 MCP-1, MIP-1에 대한 조직내교잡법을 수행한 결과에서도 이들 싸이토카인 및 케모카인이 돼지 써코바이러스가 감염된 육아종성 염증을 보이는 부위에서 발현하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 돼지 써코바이러스가 TNF-α, MCP-1, MIP-1의 발현을 유도하고, 이들 물질에 의해서 거대다핵세포 등의 육아종성 염증병변이 형성되는 것으로 추정해 볼 수 있다.
접종 실험을 통하여 이유자돈 전신성 소모성 증후군에 실험적으로 감염된 자돈으로 부터 채혈한 혈액에서 만성염증에 관여하는 싸이토카인인 TNF-α에 대한 ELISA를 실시한 결과 접종 초기에 TNF-α의 혈액내 발현양이 급격히 증가하였으며 감염일령이 증가 할수록 TNF-α가 서서히 증가하여 접종 기간 내내 높은 발현양을 유지하는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 육아종성염증의 형성과 TNF-α가 상호 밀접한 연관이 있음을 말해주고 있으며, 식용억제 물질인 cachectin으로 작용하는 TNF-α가 혈액내에 높은 농도로 발현되므로 돼지 써코바이러스 2형이 자돈들의 식욕억제에 간접적으로 작용하여 위축을 유발하는 하는 것으로 밝혀졌다.
이유자돈 전신성 소모성 증후군에 실험적으로 감염된 자돈을 가지고 혈액학적인 분석을 실시한 결과 이유자돈 전신성 소모성 증후군에 감염된 자돈에서 심한 빈혈 증상이 관찰되었으며, 골수를 채취하여 분석한 결과 많은 골수 세포에서 돼지 써코바이러스 2형에 감염된 것을 확인 할 수 있었으며, 돼지 써코바이러스 2형의 감염에 의한 빈혈의 유발을 확인 할 수 있었다.
위 결과를 종합해 보면 이유자돈 전신성 소모성 증후군은 돼지 써코바이러스 2형 단독 감염으로는 심한 증상이 유발되지 않으며 돼지 파보바이러스가 혼합감염 될 때 전형적인 이유자돈 전신성 소모송 증후군을 유발하는 것을 알 수 있었다. 또한 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 주요한 임상증상인 심한 위축은 돼지 써코바이러스 2형 감염에 의한 식욕억제 물질인 TNF-α의 발현양 증가로 유발되는 것으로 밝혀졌다. 또한 전형적인 육안 병변인 거대다핵세포 및 육아종성염증 병변은 돼시 써코바이러스 2형 감염으로 유도되는 TNF-α, MCP-1, MIP-1 등에 의해서 형성되는 것이다.
본 연구를 통하여 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 질환모델을 국내분리 돼지써코 바이러스 2형(SNUV000463)과 돼지 파보바이러스(SNUV000464)를 이용하여 확립하였으며, 이 모델을 이용하여 이유자동 전신성 소모성 증후군 예방 연구 및 만성염증반응연구에 활용할 수 있을 것이다.
나. 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스 혼합백신을 이용한 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방 연구
이유자돈 전신성 소모성 증후군으로 진단된 이유자돈으로부터 원인체인 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 파보바이러스를 분리하였으며, 순수하게 국내에서 분리한 돼지 써코바이러스 2형 (SNUV000463)을 백신제조를 위하여 PK-15 cell line을 이용하여 대량으로 증식하였으며 돼지 파보바이러스(SNUV000464)는 Swine testicle (ST) 세포를 이용하여 대량으로 증식하였다. 대량으로 증식한 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스에 포르말린을 첨가하여 불활화한 후에 알루미늄겔을 첨가하여 돼지써코바이러스 2형 및 돼지 파보바이러스 혼합 사독백신을 제작하였다.
백신의 효능을 알아보기 위하여 1주에 1cc, 3주에 추가로 1cc씩 백신을 근육접종하고 4주에 바이러스를 접종하는 실험을 실시한 결과 백신을 투여하지 않은 양성대조군의 경우 심한 위축, 기침, 설사, 황달 등 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 임상증상을 보였으나 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스 혼합백신 접종군의 경우 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 임상증상이 전혀 관찰되지 않았다. 또한 공격접종 5주후 실시한 부검 및 조직병리학적 검사결과에서도 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 전형적인 육아종성병변 및 세포질내 포도송이 모양의 세포질내 봉입체가 관찰되지 않았다. 이후 실시한 분자병리학적 실험에서도 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 파보바이러스의 증식이 대조군에 비하여 확연히 억제되는 등 본 연구를 통하여 개발한 돼지 써코바이러스 2형 및 돼지 파보바이러스 혼합백신이 이들 바이러스의 감염을 효과적으로 예방하는 것으로 판명되었다.
2. 활용에 대한 건의
가. 이유자돈 전신성 소모성 증후군 병인론 및 질환 모델 확립
본 연구를 통하여 밝혀진 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 병인론 및 질환모델은 돼지 써코바이러스 2형의 연구에 중요한 핵심 자료를 제공할 것이며, 질병을 컨트롤 하는데 많은 도움을 줄 것이다. 또한 앞으로 추가로 개발될 백신 등 예방연구에도 지속적으로 이용될 수 이용될 수 있다. 또한 이유자돈 전신성 소모성 증후군은 전형적인 바이러스성 만성 육아종성 염증 반응을 일으키는데 이번 예방연구를 통하여 얻은 TNF-α 및 싸이토카인ㆍ케모카인 연구와 빈혈 연구 결과는 이유자돈 전신성 소모성 증후군에서 관찰되는 만성 육아종성 염증반응에서 관찰되는 거대다핵세포의 생성 기전 및 중요한 임상증상인 체중감소 그리고 빈혈의 병인론 연구에 좋은 정보를 제공하였다. 또한 본 연구과제를 통하여 식욕억제 물질인 cachectin로 작용하는 TNF-α의 작용을 최초로 증명하였는데 이는 앞으로 가축의 생산성 향상에 기여할 것이다. 현재까지 본 연구과제를 통하여 얻은 실험결과는 이미 외국의 저널에 3∼4편이 발표되었으며, 앞으로도 2∼3편 이상이 투고될 예정이다.
나. 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방 백신 개발
본 연구과제를 통하여 개발되어 효과가 입증된 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방백신은 국내의 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방 및 컨트롤에 많은 효과를 보일 것이다. 또한 본 예방백신은 국제적인 개발 경쟁이 치열한 백신이므로 하루빨리 제품화를 해야 한다. 빠른 시일 이내에 국내의 동물약품업체에 기술이전을 통한 제품화 및 대량생산을 시도해야 한다. 또한 본 백신은 국제적으로 첫 번째로 상업화가 가능한 백신이므로 수출을 통한 많은 부가가치의 창출도 기되 된다.

Abstract ▼

Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) is causally associated with infection by porcine circovirus 2 (PCV2) (Allan and Ellis, 2000; Kim and Chae, 2001a, b). PMWS occurs in swine herds that are usually in good health; it has a low morbidity rate but is associated with a relatively high fat

Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) is causally associated with infection by porcine circovirus 2 (PCV2) (Allan and Ellis, 2000; Kim and Chae, 2001a, b). PMWS occurs in swine herds that are usually in good health; it has a low morbidity rate but is associated with a relatively high fatality rate in 5- to 12-week-old pigs. Clinically, the disease is characterized by progressive weight loss, respiratory signs and jaundice. Histopathologically, it is characterized by widespread granulomatous inflammation, multinucleated giant cells, and variable numbers of intracytoplasmic basophilic viral inclusion bodies within infiltrating histiocytes and macrophages.
Since its first description in Western Canada, PMWS has been reported in many swine-raising countries, most notably in North America, Europe and Asia. PMWS has recently become recognized as an important disease of swine in Korea. In the 2-year period 1999-2000, tissues from over 1500 postweaning pigs were examined diagnostically at the Department of Veterinary Pathology, Seoul National University. PMWS was diagnosed in 133 cases (8.1 %), which represented a 5-fold increase in cases diagnosed in the previous two years. Natural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), recorded from January 1999 to December 2000, were determine the prevalence, microscopic lesions, and other coexisting pathogens associated with PMWS. One hundred and thirty three (8.1%) of the 1634 pigs submitted from 1243 pig farms were diagnosed for PMWS. The majority of cases (113 cases, 85.0%) was dual infection with other pathogens. The combination of PCV2 and Hemophilus parasuis (43 cases, 32.3%) was shown to be the most prevalent followed by PCV2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (39 cases, 29.3%).
This project is consists of two main parts: pathogenesis of postweaning multisystemic wasting syndrome, development of vaccine for postweaning multisystemic wasting syndrome.
Thirty-two colostrum-deprived conventional pigs aged 28 days were co-infected with Korean isolates of porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine parvovirus (PPV) for a period of 35 days post-inoculation (dpi). Histopathologically, granulomatous inflammation, with or without intracytoplasmic inclusion bodies, was present in lymphoid tissues (e.g., lymph nodes, thymus, spleen and tonsil) from 20 dpi, being most severe at 24 dpi. PCV2 and PPV DNA were detected in the lymph nodes from 3 to 35 dpi by in-situ hybridization, but the labelling for both viruses was particularly intense and widespread at 20 and 24 dpi. A close relationship between the cells labelled for PCV2 and those labelled for PPV was revealed by examination of serial sections from lymph nodes, and PCV2 and PPV were also detected in peripheral blood monocytes from 3 to 35 dpi. Other tissues and cells in which PCV2 and PPV DNA were detected included macrophages in the tonsil, thymus, spleen, lung, liver, kidney and heart. Significantly more PCV2-positive cells than PPV-positive cells were detected in the lymph nodes at 5 to 35 dpi. The pathogenesis of PMWS reproduced in this study may be suggested thus: initial virus entry through tonsillar macrophages, followed within 3 days by viraemia; PCV2 and PPV replicate, at least to some extent, in circulating peripheral monocytes, contributing to the cell-associated viraemia and to virial distribution throughout the lymphoid tissues.
In an experiment, the expression of monocyte chemoattractant protein-1 and macrophage inflammatory protein-1 was determined in granuomatous inflammation of the lymph node by semiquantitative reverse transcrition-polymerase chain (RT-PCR), granulomatous lesion score, and in situ hybridization over a period of 35 days after intranasal inoculation by porcine circovirus 2. Maximum MCP-1 and MIP-1 expression was observed in pigs at 21 dpi followed by most severe granulomatous lesions at 24 dpi. Detection of MCP-1 and MIP-1 expressing cells precedes granulomatous inflammation formation. A very close cell to cell correlation between PCV2 and chemokines (MCP-1 and MIP-1) in serial sections from lymph nodes suggests that induction of MCP-1 and MIP-1 is a direct response to PCV2.
The results described in this study provide evidence for the ability of MCP-1 and MIP-1 to induce granulatous inflammation in vivo.
This study investigated the potentiation of porcine circovirus 2 (PCV2)-induced postweaning multisystemic wasting syndrome by porcine parvovirus (PPV) and found it was associated with excessive production of tumor necrosis factor-α (TNF-α). Colostrum-deprived conventional pigs were inoculated intranasally with PCV2 and PPV alone or in combination (PCV2 and PPV). In vitro assay of TNF-α, obtained from alveolar macrophages coinfected with PCV2 and PPV showed a significant increase in TNF-α compared to single infection of macrophages with either PCV2 or PPV alone (P < 0.05). All pigs inoculated with PCV2 and PPV developed severe postweaning wasting syndrome whereas pigs that were inoculated with PCV2 or PPV alone did not. Compared to the pigs inoculated with PCV2 or PPV alone, pigs inoculated dually with PCV2 and PPV showed significantly (P < 0.05) increased levels of TNF-α. Levels of TNF-α in the sera were reversely correlated with the body weight in pigs experimentally infected with dual inoculation of PCV2 and PPV (rs = -0.92, P < 0.001). These data demonstrate a potentiation of PPV in PCV2-associated PMWS by the excessive production of TNF-α.
The present study demonstrated that hematopoietic cells in the bone marrow is important targets for the PCV2 infection. The role of PCV2 infection in the pathogenesis of anemia remains unclear. Evidence for this comes from immunohistochemical study of bone marrows from pigs at various times following infection with PCV2 at 28 day old. The hematopoietic cells in the bone marrows are the cells in which PCV2 antigen is detected after infection. Therefore, PCV2 has been implicated in bone marrow failure by a variety mechanisms, including virus infection of hematopoietic cells. Although PPV clearly potentiated PCV2-associated anemia in dually infected pigs, PPV was difficult to demonstrate in bone marrow. There are precedents for the synergistic effects of other viruses in potentiating circovirus disease.
Since no PCV2 vaccine was available so far, we have developed a specific killed vaccine against PMWS. This vaccine is mixture of killed PCV2 and PPV with formalin. The piglets received two times injection; a first injection at 7 days old and a second injection at 21 days old. And PCV2 and PPV was inoculated a seven days later. As evaluated by growth parameters, clinical signs, seroconversion, the pigs were protected against PCV2 and PPV challenge after vaccination. This vaccine induces protective immunity against PCV2 and PPV infection and could potentially serve as an effective vaccine.

목차 Contents

• 최종보고서 ... 1
• 표지 ... 2
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 13
• CONTENTS ... 17
• 목차 ... 19
• 제1장 서론 ... 21
• 제2장 이유자돈 전신성 소모성 증후군 병인론 및 질환모델 개발 ... 26
• 제1절 서설 ... 26
• 제2절 재료 및 방법 ... 28
• 1. 국내분리 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스를 이용한 이유자돈 전신성 소모성 증후군 질환모델 개발 ... 28
• 2. 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스의 상관관계 분석 ... 32
• 3. 성장정체를 유발하는 식욕억제 물질(cachectin) TNF-α의 분석 ... 35
• 4. 빈혈의 원인 분석 ... 39
• 5. 화학주성인자(Chemokine) MCP-1, MIP-1 분석 ... 40
• 제3절 결과와 고찰 ... 43
• 1. 국내분리 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스를 이용한 이유자돈 전신성 소모성 증후군 질환모델 개발 결과 ... 43
• 2. 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스의 상관관계 분석 ... 51
• 3. 성장정체를 유발하는 식욕억제 물질(cachectin) TNF-α의 분석 결과 ... 58
• 4. 이유자돈 전신성 소모성 증후군에서 관찰되는 빈혈의 원인 분석 결과 ... 66
• 5. 화학주성인자(Chemokine) MCP-1, MIP-1 분석 결과 ... 69
• 제3장 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방백신 개발 ... 74
• 제1절 서설 ... 74
• 제2절 재료 및 방법 ... 76
• 1. 백신의 제조 ... 76
• 2. 백신에 의한 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방효과 평가를 위한 바이러스 공격접종 실험 ... 79
• 제3절 결과와 고찰 ... 90
• 1. 백신의 개발 ... 90
• 2. 백신에 의한 이유자돈 전신성 소모성 증후군 예방효과 평가를 위한 바이러스 공격접종 실험 ... 92
• 제 6 장 인용문헌 ... 104
• 끝페이지 ... 116