초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1.연구개발 결과
본 과제에서는 근세포 분화에 관여하는 유전인자들을 분자생물학적 기법을 이용하여 다형성과 그에 따른 유전자형을 규명하고 성장 및 산육형질과의 연관성 분석을 통해서 표지유전자를 선정하였다. 이렇게 선정된 표지유전자를 통한 근육성장과 조직학적 발달에 대한 이화학적 변이를 규명함으로써 그 활용성을 입증하였다.
본 연구개발 결과를 요약하면 다음과 같다.
가. 근섬유 발달관련 DNA 표지유전자 탐색
○ 근육의 형성 및 성장에 관련된 유전자를 중심으로 Inte

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1.연구개발 결과
본 과제에서는 근세포 분화에 관여하는 유전인자들을 분자생물학적 기법을 이용하여 다형성과 그에 따른 유전자형을 규명하고 성장 및 산육형질과의 연관성 분석을 통해서 표지유전자를 선정하였다. 이렇게 선정된 표지유전자를 통한 근육성장과 조직학적 발달에 대한 이화학적 변이를 규명함으로써 그 활용성을 입증하였다.
본 연구개발 결과를 요약하면 다음과 같다.
가. 근섬유 발달관련 DNA 표지유전자 탐색
○ 근육의 형성 및 성장에 관련된 유전자를 중심으로 Internet을 통해 후보유전자를 검색한 결과 근섬유세포 발달단계에 역할이 많은 것으로 알려진 MyoD gene family를 선정하였다.
○ MyoD gene family 중에서도 myotube에서 muscle fiber로의 분화에 가장 큰 역할을 하는 myogenin 유전자를 근섬유형성과 발달에 주요한 역할을 한다는 점에서 후보유전자로 선정하고, myogenin에 앞서서 발현되며 myogenin의 발현을 조절하는 것으로 알려진 Myf-6 유전자를 추가로 연구하였다.
○ Myogenin 유전자가 양적으로 혹은 질적으로 발현양상에 차이가 있는지 확인해 보기 위해서 myogenin 유전자의 profile 분석을 실시하였고, mRNA 수준의 발현양상을 분석하기 위해서 RT-PCR을 수행해 본 결과 myogenin 유전자의 발현양에 차이가 있음을 확인하였다.
○ Myogenin 유전자의 발현에 차이를 줄 수 있는 요인을 분석하기 위해서 5‘ promoter region을 분석할 필요가 있었고, 이 부분의 동정을 위해서 Cloning을 실시하였다.
○ Cloning을 통해서 확보된 5‘ promoter region의 염기서열을 분석하였고 염기서열 분석결과 기존에 보고되지 않았던 한 개의 SNP site를 발견하였다.
○ SNP에 따른 TT,TC,CC 세 개의 유전자형을 결정짓고, 이러한 유전자형의 손쉬운 탐색을 위해서 BspCNI 제한효소를 이용한 PCR-RFLP 진단기법을 개발하였다.
나. DNA 표지유전자형에 따른 근육성장 및 조직학적 발달분석
○ 현재 국내에서 이용되고 있는 Yorkshire종을 이용하여 실험축군을 조성하였다. 이에 품종간의 차이를 확인하기 위해서 역시 국내에서 이용되고 있는 Landrace종을 실험군에 추가하였다.
○ 실험개체군의 성장능력관련 형질의 분석결과 기존의 보고보다 성장능력면에서 우수했지만, 조직학적인 특성은 기존의 연구와 비슷한 결과를 나타냈다.
○ 품종별 성장능력관련 형질의 분석결과 성장능력면이나 근섬유 발달면에서 Landrace가 Yorkshire종에 비해서 우수하게 나타났지만, 육질은 저조한 것으로 관찰되었다.
○ 근섬유 수나 크기에 따른 성장능력 및 도체성적의 연관성 분석결과 근섬유 수와 크기가 부의상관관계를 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 근섬유수가 많은 개체가 산육형질이 우수하고, 근섬유가 큰 개체가 성장형질이 우수하였다. 이러한 점을 근거로 근섬유수가 많고 큰 개체를 선발하기 위한 표지유전자의 탐색 방향을 제시하였다.
○ 근섬유 형성과 관련한 후보유전자로 선정된 Myogenin의 5‘ promoter region에서 발견된 SNP와 Myf6의 Intron 1 region과 5’ promoter region의 SNP에 대하여 나타난 유전자형의 분포를 조사하였다.
○ 이렇게 밝혀진 유전자형과 근육성장 및 조직학적 발달항목과의 연관성 분석을 통해서 성장형질 및 육질에 변화를 주지 않으면서 산육형질에 증가를 가져올 수 있는 표지유전자형으로서 Myogenin의 TC 유전자형과 Myf6의 BB 유전자형이 적절할 것으로 판단하였다.
○ 최종적으로 Myogenin과 Myf6의 유전자형간의 haplotyping을 통해서 복합 표지유전자로서의 활용성을 검정하였고, 최적의 haplotype으로 BBTC 형이 선정되었다. 또한 표지유전자 진단의 보편화를 모색하기 위해서, 동일한 실험조건 안에서 시행되었던 PCR-RFLP 표지유전자 진단방법을 동일인식 부위를 갖는 다른 제한효소로 처리해 봄으로써 동일한 결과를 얻을 수 있었고, 이를 통해서 새로이 선정된 표지유전자의 보편적인 활용성을 입증 할 수 있었다.
다. 근육성장과 조직학적 발달에 대한 이화학적 기전 및 육질변이
○ 근육성장과 관련된 조직학적 특성변이에 따른 근육의 대사적, 생화학적 특성을 관찰하기 위해 근육 내 이화학적 특성 분석을 실시하였다. 조직학적 특성 분석결과 돈육 등심근의 경우 대부분 근섬유 type IIB로 구성되어 있어 등심근의 강한 혐기적 대사능력을 나타냈으며, 성별간의 뚜렷한 차이는 나타내지 않았다.
○ 근육의 조직학적 특성이 돈육질에 미치는 영향을 분석하기 위해 전체 실험군을 정상육(reddish-pink, firm, and non-exudative, RFN)과 이상육(pale, soft, exudative, PSE; reddish-pink, soft, and exudatie, RSE)으로 구분하여 각 그룹간 차이를 분석하였으며, 그룹 간 보수력 및 육색 등 육질변이가 뚜렷했다.
○ 근섬유 수와 크기 조성의 경우, PSE 그룹의 type IIB 조성이 RSE, RFN 그룹에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내 이상육 그룹의 강한 혐기적 대사능력을 나타냈으며, 이러한 이상육의 대사특성은 육질저하에 영향을 미친 것으로 판단된다. 따라서 type IIB fiber의 조성을 근육의 대사적 특성을 나타내는 중요 평가항목으로 활용가능 하다고 판단된다.
○ 근육의 조직생화학적 특성과 성장특성 및 도체특성과의 연관성 분석 결과 근섬유 수와 크기는 산육량 증대에 작용한 것으로 평가되며, 특히 근섬유 수는 적육 생산능력과 연관성이 큰 것으로 분석되었다.
○ 돈육질 관련 생체요인을 탐색해본 결과 근육의 주요 에너지원인 ATP, glycogen, G6P의 농도와 대사산물인 lactate 농도의 경우 육질변이와 육질예측에 있어 적합한 항목으로 판단된다.
○ 이와 같이 근육의 조직학적 특성인 근섬유 수와 크기는 근육의 생산능력의 지표로 이용가능하며, 근육의 대사적/이화학적 특성을 나타내는 근섬유 조성은 사후 대사변이 및 육질변이에 영향을 미치는 것으로 분석되어 표지유전자 실용화 구축에 있어 중요 지표로 판단된다.
○ 근육의 조직학적/대사적 변이를 이용한 이상돈육의 발생원인을 정리하면 다음과 같다.
(1) 근섬유 type IIB fiber 조성의 증가는 PSE 및 RSE 육에서 나타나는 사후대사의 가속화 현상을 설명하는 변수로 활용가능하다.
(2) Late developing PSE 및 RSE육의 발생은 사후 초기 높은 glycogen 함량 및 사후대사의 범위로 설명 가능하다.
(3) RSE육은 경증의 PSE육으로 판단되며 근육 pH 및 단백질 변성이 더 심화될 경우 PSE육으로 전환될 수 있다.
(4) RSE육 발생의 또 다른 기전은 단백질 변성 외에 최종 pH 저하에 의한 myofilament lattice 공간의 감소에 의한 보수성 저하로 설명될 수 있다.
(5) 이상돈육의 발생은 사후 대사속도와 대사범위뿐 아니라, 근육을 구성하는 단백질 및 각 단백질의 변성민감도의 차이에 의해 설명될 수 있다.
(6) 육질의 변이는 근섬유 조성과 같은 내인성 요인과 도축 전후 외부적 요인의 상호작용에 의해 결정되는 종합적인 현상이다.
○ 표지유전자 MG5' 및 Myf-6 유전자 좌위의 유전자형이 산육형질 및 육질 변이에 미치는 영향을 분석해 보면, MG5' 유전자의 TC 유전자형은 성장특성 및 적육생산 능력이 우수하였는데, 이는 TC 유전자형의 많은 근섬유 수에 의한 것으로 분석되었으며, TC 유전자형을 가진 개체는 정상육 수준의 육질을 나타냈다.
○ Myf-6 유전자 좌위의 BB 유전자형의 경우 근섬유 수는 높게 나타냈으며 돈육질 항목에서는 유전자형 간에 차이가 없었다. 따라서 MG5' 유전자의 TC와 Myf-6의 BB 유전자형은 근섬유 수 분화에 영향을 미쳐 적육생산 능력 증가를 가져오면서 돈육질을 향상시킬 수 있는 표지유전자라고 판단되며, 표지유전자 실용화 기준에 적합한 유전자라고 판단되었다.
○ 표지유전자로 검증된 Myf-6와 MG5' 유전자 좌위의 haplotype에 따른 돈육질 변이를 분석한 결과, BBTC 유전자형은 근섬유의 조직학적 특성 중 근섬유의 수 증가를 통해 근육 생산 및 산육량 증대에 영향을 미쳤으며, 사후 대사변이 및 돈육질 변이에는 관여하지 않아 육질이 향상된 적육형 돈육생산에 적합한 haplotype으로 분석되었다.
○ 표지유전자 및 근육의 조직학적 특성을 이용한 군집을 설정하여 표지유전자 실용성 검증 및 돈육질 변이를 분석하였다. 성장속도가 빠르고 우수한 적육 생산능력을 지니고 있는 HH 군집의 특성은 높은 근섬유 수와 밀도에 의한 것으로 판단된다.
○ 군집간의 뚜렷한 대사적 특성 변이는 나타내지 않았다. 또한 군집에 따른 육질변이 분석결과 군집간 뚜렷한 차이는 나타내지 않아, HH 군집의 경우 적육량이 우수하면서 돈육질이 향상된 모델로 분석되었으며, 표지유전자로 검증된 Myf-6와 MG5' 유전자좌위의 BBTC 유전자형 모델과 일치하는 특성을 지닌 것으로 평가되었다.
2. 활용에 대한 건의
○ 각 종돈장에서 보유하고 있는 종모돈에 대해서 표지유전자의 유전자형을 실시하고, 앞서 선정된 유전자형을 갖는 종모돈을 선발하고 확보한다.
○ 표지유전자의 개발에 따른 기술습득과 유전자 및 이들의 기능에 대한 자료는 경제형질에 근거한 육종에 활용될 수 있으며 유전자 변환 돼지의 생산에도 기초자료로 이용될 수 있다.
○ 유전자 진단기법의 개발로 단순화와 양돈산업체제의 권역별 분권화 등이 동반되면 현장화가 가능할 것이다.
○ 본 연구를 통하여 축적된 정보 및 기술은 돼지는 물론 타 동물 중에서의 양적 형질의 분석에 활용될 수 있다.
○ 산육형질과 관련된 유전기구의 운용기전 및 근육내 이화학적 특성에 대한 세포 수준에서의 구명이 이루어져 추가 연구에 활용될 수 있다.

Abstract ▼

It is important to understand skeletal muscle growth and development since it has a close relationship with meat quality of meat producing domestic animals. Muscle is composed of muscle fibers and total muscle content of an individual is dependent on increase in muscle fiber number before birth and

It is important to understand skeletal muscle growth and development since it has a close relationship with meat quality of meat producing domestic animals. Muscle is composed of muscle fibers and total muscle content of an individual is dependent on increase in muscle fiber number before birth and in muscle size after birth. Since muscle growth during postnatal period is not an unlimited process, but is controlled by genetic and physiological status, number of the muscle fiber which is decided during the prenatal development is rather important for ability to produce red muscle. To date, genes associated with muscle growth and differentiation have not been intensively studied as yet. Identification and investigation of these genes will help elucidate their effects on expression of structural proteins consisting the muscle and the muscle differentiation. It is also expected that use of genetic markers will lead to higher production efficiency as well as to decrease in production cost by establishing reasonable breeding indices.
This study was carried out to identify genetic makers associated with muscle growth and differentiation using the candidate gene approach and physico-chemical analysis.
Candidate gene were selected through studying Genebank database and previously published reports. Myogenin family of genes and those speculated to have effects on muscle development were examined using PCR-RFLP analyses. Allele frequencies were determined. Cloning and nucleotide sequence analysis were done to search SNP. Gene expression profile was studied using RT-PCR. Various conditions were examined to establish a standard genetic diagnosis system for a selected DNA marker.
Statistical analysis was performed to correlate meat quality and muscle fiber development.
Physico-chemical properties of various haplotypes were analysed using parameters including growth, meat production and meat quality.
Histological examination was carried out to group by meat quality. Metabolic rates and degree of protein degradation were examined to determine biochemical factors affecting meat quality.
Concentrations of ATP, glycogen-6-hosphate(G6P) and lactate measured to identify intrinsic elements influencing muscle properties. Finally, physico-chemical data were correlated to results from the PCR-RFLP analyses to determine genetic markers for the muscle growth and differentiation.
Statistical analysis was carried out using SAS/STAT 9.13 package throughout this study.
Molecular biological tools were employed to identify genes that had been suggested to influence differentiation of the muscle fiber. Statistical analyses were carried out to determine genetic markers by correlating genotypes with growth performances and meat production traits.
Physiochemical analyses were also performed to examine effects of the genetic markers. Results are summarized as follows;
Identification of DNA markers associated with the muscle fiber development and analysis of correlation between genotypes and muscle growth and pysicochemical characteristics MyoD family of gene were selected as candidates through database screening.
RFLP analysis showed that there were polymorphic sites in the 5'-regulatory region of the myogenin gene.
Cloning and sequence analysis revealed an SNP site in the 5'regulatory region of the myogenin.
Genotypes of the myogenin are TT, TC and CC.
RFLP polymorphisms were found in the 5'-regulatory region and within intron 1 of the myf6 gene.
Genotypes found to have positive effects on meat quality are TC of the myogenin and BB of the myf4, respectively, and BBTC haplotype was chosen as a possible selectable marker for muscle fiber growth and differentiation.
RT-PCR analysis revealed expressions of the myogenin and the myf6 were affected by genotypes.
Physicochemical mechanism for the muscle and its histologial development
Physicochemical analysis of the muscle was carried out to examine changes in metabolic and biochemical properties upon different histological conditions associated with muscle growth.
Major muscle fiber type in the longissmus muscle was typeIIB indicating strong anaerobic metabolic capability. No difference was found between males and females
Effects of histological properties on meat quality was also examined. There marked differences in degree of meat quality indices including water content and meat color among three meat type groups RFN, PSE and RSE).
PSE meat was shown to have higher number of typeIIB fibers significantly.
It was also shown that number and size of fibers may affect increase in total muscle mass.
Lactate concentration was found to be an appropriate prognostic tool for the meat quality.
Underlying causatives for the meat quality changes are summarized as follows; Increase in typeIIB fiber content facilitate postmortem metabolism.
Late developing PSE and RSE meats can be explained by glycogen content and postmortem metabolism during early postmortem period.
Another mechanism for the RSE is, apart from protein degradation, spatial decrease in myofilament lattice due to decreases in the final pH and water content.
Myogenin genotype TC showed better growth performance and red-meat production due to its association with higher number of muscle fiber number. It was also shown that meat quality of the TC genotype was mostly RFN.
The HH group that showed higher growth rate and better red meat production exhibited higher number of fibers and their density.
There was no difference in metabolic characteristics between groups.
The BB type of the myf6 gene showed to associated with higher number of fibers.
The BBTC haplotype group was shown to have higher number of fibers resulting in higher production efficiency of red meat and total muscle mass.
Genotyping results were shown to correlate with results from the physico-chemical analyses.
Genetic diagnosis condition was adjusted using selected markers and their primers.
Our data suggest that genetic makers from this study could be used for selection and breeding programs in pig. It is also expect that informations developed here will influence similar areas in other domestic animals. Further studies will be helped by data obtained from our physico-chemical analyses.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 요 약 문 ... 5
• SUMMARY ... 12
• LIST OF CONTENTS ... 15
• 목 차 ... 17
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 19
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 21
• 1. 기술적 측면 ... 21
• 2. 경제⋅산업적 측면 ... 22
• 3. 사회⋅문화적 측면 ... 23
• 제 2 절 연구개발의 목표와 내용 ... 24
• 1. 시험가축확보 및 시험축군 조성 ... 24
• 2. 근섬유 발달관련 DNA 표지유전자 탐색 ... 24
• 가. 근섬유 발달 관련 유전자 및 그들의 발현 profile 분석 ... 24
• 나. 표지유전자 cloning ... 25
• 다. 유전자의 염기서열 분석 ... 25
• 3. DNA 표지유전자형에 따른 근육성장 및 조직학적 발달 ... 25
• 가. 실험개체군의 근육성장관련 형질 분석 ... 25
• 나. 표지유전자에 따른 근육성장 및 조직학적 발달분석 ... 26
• 다. 표지유전자의 실용화 및 검증 ... 26
• 4. 근육성장과 조직학적 발달에 대한 이화학적 기전 및 육질변이 ... 27
• 가. 근육성장관련 형질의 이화학적 특성 분석 ... 27
• 나. 근육분화형질을 이용한 돈육질 변이요인 탐색 ... 27
• 다. 산육량 증가와 돈육질 변이간의 연관성 분석 및 작용기전 규명 ... 27
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 29
• 제 1 절 국내·외 기술 현황 ... 31
• 제 2 절 앞으로의 전망 ... 33
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 35
• 제 1 절 연구개발수행 방법 ... 37
• 1. 근섬유 발달관련 DNA 표지유전자 탐색 ... 38
• 가. 근섬유 발달 관련 유전자 및 그들의 발현 profile 분석 ... 38
• 1) Internet을 통한 근섬유 발달 관련 후보유전자 검색 ... 38
• 2) 유전자 및 유전자 발현 profile 분석 ... 38
• 나. 표지유전자 cloning ... 38
• 다. 유전자의 염기서열 분석 ... 39
• 라. 표지유전자형 탐색용 진단기법 개발 ... 40
• 1) 종간 및 개체간의 특이성 탐색 ... 40
• 2) 표지유전자형 탐색용 진단기법 개발 ... 40
• 2. DNA 표지유전자형에 따른 근육성장 및 조직학적 발달분석 ... 41
• 가. 실험개체군의 근육성장관련 형질 분석 ... 41
• 1) 실험가축 확보 및 시험축군 조성 ... 41
• 2) 조사항목 측정방법 ... 41
• 3) 통계분석 방법 ... 42
• 나. 표지유전자에 따른 근육성장 및 조직학적 발달분석 ... 43
• 다. 표지유전자의 실용화 및 검증 ... 43
• 1) 복합표지유전자의 활용성 검토 ... 43
• 2) 표지유전자의 실용화 ... 44
• 3. 근육성장과 조직학적 발달에 대한 이화학적 기전 및 육질변이 ... 45
• 가. 근육성장관련 형질의 이화학적 특성분석 ... 45
• 나. 표지유전자형에 따른 도체특성 및 육질분석 ... 47
• 다. 산육량 증가와 돈육질 변이간의 연관성 분석 및 작용기전 규명 ... 48
• 제 2 절 연구수행 내용 및 결과 ... 51
• 1. 근섬유 발달관련 DNA 표지유전자 탐색 ... 51
• 가. 근섬유 발달 관련 유전자 및 그들의 발현 profile 분석 ... 51
• 1) Internet을 통한 근섬유 발달 관련 후보유전자 검색 ... 51
• 2) 유전자 및 유전자 발현 profile 분석 ... 52
• 나. 표지유전자 cloning ... 56
• 다. 유전자의 염기서열 분석 ... 57
• 1) Porcine myogenin 5' promoter region의 염기서열 분석 ... 57
• 2) Porcine myogenin 유전자 구조 및 분석 ... 60
• 라. 표지유전자형 탐색용 진단기법 개발 ... 61
• 1) 종간 및 개체간의 특이성 탐색 ... 61
• 2) 표지유전자형 탐색용 진단기법 개발 ... 62
• 2. DNA 표지유전자형에 따른 근육성장 및 조직학적 발달분석 ... 67
• 가. 실험개체군의 근육성장관련 형질 분석 ... 67
• 1) 시험가축확보 및 시험축군조성 ... 67
• 2) 실험개체군의 성장능력관련 형질 분석 ... 67
• 3) 품종별 연차별 성장능력관련 형질 분석 ... 69
• 4) 근섬유 수·크기에 따른 성장능력 및 도체성적의 연관성 분석 ... 75
• 나. 표지유전자에 따른 근육성장 및 조직학적 발달분석 ... 79
• 1) 유전자 다형성 분포 조사 ... 79
• 2) 유전자 다형성과 형질과의 상관분석 ... 83
• 3) 산육형질 관련 표지 유전자 선발 ... 98
• 다. 표지유전자의 실용화 및 검증 ... 98
• 1) 복합표지유전자의 활용성 검토 ... 98
• 2) 표지유전자의 실용화 ... 103
• 3. 근육성장과 조직학적 발달에 대한 이화학적 기전 및 육질변이 ... 106
• 가. 근육성장관련 형질의 이화학적 특성 분석 ... 106
• 1) 도체특성 및 육질분포 분석 ... 106
• 2) 근육의 조직학적 특성 분석 ... 109
• 3) 근육의 이화학적 변이 분석 ... 116
• 나. 표지유전자형에 따른 도체특성 및 육질 분석 ... 120
• 1) 표지유전자형에 따른 근육의 조직학적/대사적 변이 분석 ... 120
• 2) 표지유전자 및 근육의 이화학적 특성을 이용한 돈육질 변이 요인 탐색 ... 132
• 3) 산육형질 및 돈육질 변이 관련 생체요인 탐색 ... 136
• 다. 산육량 증가와 돈육질 변이간의 연관성 분석 및 작용기전 규명 ... 142
• 1) 도축 전·후의 대사변이 요인 규명 ... 142
• 2) 표지유전자 실용화에 따른 육질변이 검증 ... 151
• 3) 표지유전자 및 근육의 조직학적 특성을 이용한 돈육질 modeling ... 161
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 167
• 제 1 절. 목표달성도 ... 167
• 제 2 절. 관련분야에의 기여도 ... 170
• 가. 기술적 측면 ... 170
• 나. 경제·산업적 측면 ... 170
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 171
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 172
• 제 7 장. 참 고 문 헌 ... 174
• 끝페이지 ... 182