초록 ▼

○ 연구결과
본 연구를 통하여 pseudomonas fluorescens의 적정 배지로 알려진 KB배지 보다 본 연구에서 개발한 siderophore 대량 생성 배지를 이용하여 siderophore의 생성량을 극대화 할 수 있어 기존의 pseudomonas fluorescens의 mutant를 이요한 방법보다 경제적 이점을 최대로 얻을 수 있었으며, PGPR 및 병억제를 동시에 제어할 수 있었다. 동적된 PGPR물질은 siderophore류 pseudobactin으로 확인되었고, 추가적인 물질 분리 과정에서 생성된 crysta

○ 연구결과
본 연구를 통하여 pseudomonas fluorescens의 적정 배지로 알려진 KB배지 보다 본 연구에서 개발한 siderophore 대량 생성 배지를 이용하여 siderophore의 생성량을 극대화 할 수 있어 기존의 pseudomonas fluorescens의 mutant를 이요한 방법보다 경제적 이점을 최대로 얻을 수 있었으며, PGPR 및 병억제를 동시에 제어할 수 있었다. 동적된 PGPR물질은 siderophore류 pseudobactin으로 확인되었고, 추가적인 물질 분리 과정에서 생성된 crystal에 대해서는 보다 정밀한 분석이 작업이 필요햇다.
또한, 최근 종자사업에서 활발히 응요오디고 있는 종자 priming 처리방법과 연관지어 유용 미생물을 종자에 Biopriming하고 미생물의 활력유지에 가장 적절한 pelleting 재료와 binder의 탐색 및 적용을 통한 최적의 미생물 종자 pelleting 방법을 개발하였다. 도한 농가 실증 실험을 통해 지역별 포장에서의 유묘초기 생장초기 생장촉진 및 토양병억제 효과를 검증하였으며, 미생물 pelleting 종자의 시제품 “BioCaps"를 개발하였다.

Abstract ▼

To isolate the beneficial microorganisms that can promote vegetable growth and supress soil borne disease, different fields were surveyed intensively where potato and chinese cabbage have been cultivated. Total 233 bacterial strains were isolate from different rhizosphere.
Pseudomonas fluorescens

To isolate the beneficial microorganisms that can promote vegetable growth and supress soil borne disease, different fields were surveyed intensively where potato and chinese cabbage have been cultivated. Total 233 bacterial strains were isolate from different rhizosphere.
Pseudomonas fluorescens are known to inhibit plant pathogenic fungi in the sugar beet rhizosphere. Production of secondary metabolites, e,g., antibiotics, Fe-chelating siderophores, and cyanide, is most often associated with fungal supression by Pseudomonas Pliorescens in the rhizosphere of sugar beets. moreover Pseudomonas fluorescens includes strains able to promote plant growth and supress plant pathogens through a production of 2,4- diacetylphloroglucinol (Phl) and phenazine.
Microbes are applied to perform specific fuctions which benefit plant productivity. Including biological nitrogen fixation, phosphate solubilization. plant growth promotion and biological of pathogens. With increased public awareness of the potential environmental and health hazaeds of chemicals and advances in biotechnoloy to improve the performance of microorganisms to seeds may become more popular.
The practice of applying beneficial microorganisms to seeds has not. however, always been very popular. firstly because chemical treatments have been used so successfully and secondly because of the inconsistent performance of many microbial products. Often the inconsistent performances can be traced to inappropriate formulations.
The most important criterion of success in formulating microbes is the ability to deliver a critical number of viable microorganisms consistently. How many microbes need to be delivered depends on the biological activity of the microbes, the size of the seeds and their spacing when planted.
Dry powder and dry granules are most successfully produced with spore-forming microbes. Drying processes such as spray-dry, freeze-dry or air-dry(with or without the use of a fluidized bed) are used. Additional cost is usually incurred by the drying processes, although there could be savings in transporation costs. Certain protectants such as skimmed milk and gelatin are sometimes included to increase microbial yield and stabilize the products.
Formulated microbes can be treated with seed. For example seed coating, seed pelleting and mixed with the seed at planting.
Pelleting of seed is the best performed with a formulation containing dormant mcrobes since dessication and substances present on the seed coat are deleterous to metabolically active microbes upon prolonged exposure.
Formulations that contain a high moisture level are not desirable since the moisture may swell the seed coat, weaken the physical strength of the seed and trigger premature seed germination. By engineering additional biological activities ito the inoculant strains, the use of microbial inoculants as seed treatments may expand beyond its present scope and help develop new marks in agriculture.
Double pelleting is a process designed to alter the timing of microbial activity on Pseudomonas fluorescens treated seeds to favour the bioprotectant. This process consists of a slurry coating of Pseudomonas fluorescens applied to the seed.
This study was conducted to screen the antagonistic bacteria which inhibit the growth of plant pathogen and promote the growth of plant. We isolated an effective bacterial strains and investigated into the antifungal activity of the antagonistic microorganism and it's identification. 6 bacterial strains which strongly inhibited Pyricularia grisea, Phythium ultimum, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Mycosphaerella melons, Phytophthora capsici, Alternaria solani, Fusarium oxysporum and the best antagonistic bacterial strain designated as BIG21003, was selected. The antagonistic strain BIG21003 was identified to be the genus Bacillus sp. based on the morphological and biochemical characterization.
Pelleting seed with K95009 strain was planted in 5 different areas. we investigate the effect of microbial product on microorganisms in soil and the growth of leaf lettuce and onion. The results were summarized as follows : Among application of microorganisms treatments by pelleting including K95009 strain was effective considering growth of leaf lettuce and onion as compared control plot. specially soil drenching treatments shows the most significant.
The change of microorgnisms number in soil for cultivation of leaf lettuce and onion was a little decreased with pellecting seed including microorganisms treatment plot as compared with soil dreching.
In this study we tried to employ PGPR isolates for plant growth insteaed of chemical pestcides to enchance the seed vigor as well as to produce healthy stands and growth promotion.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• Contents ... 10
• 목차 ... 12
• 1장 연구개발과제의 개요 ... 17
• 1. 유용 미생물의 선발 및 동정 ... 17
• 2. 배양 최적화 연구 ... 17
• 3. 미생물 안정적 제제 개발 ... 19
• 4. 주요 작물의 생리적 특성 및 priming 조건 구명 ... 21
• 5. Seed pelleting 기술 개발 ... 21
• 6. 미생물 pelleting 종자의 생장촉진 활력 검증 ... 22
• 7. 미생물 펠렛팅 종자의 길항력 검증 ... 23
• 8. 농가 실증 포장시험 ... 24
• 9. 생장촉진 물질의 성분 분석 및 성분 구명 ... 24
• 2장 국내·외 기술개발 현황 ... 26
• 3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 29
• 1절 유용 미생물의 선발 및 동정 ... 29
• 1. 유용 미생물의 선발에 따른 길항성 검정 ... 29
• 가. 서언 ... 29
• 나. 재료 및 방법 ... 29
• 1) 1차 유용 미생물의 선발 및 길항성 검정 ... 29
• 2) 2차 유용 미생물의 선발 및 길항성 검정 ... 30
• 나. 결과 및 고찰 ... 32
• 1) 1차 유용 미생물의 선발 및 길항성 검정 ... 32
• 2) 2차 유용 미생물의 선발 및 길항성 검정 ... 34
• 2. 유용 미생물의 작물생장촉진효과 검정 ... 35
• 가. 재료 및 방법 ... 35
• 1) 발아촉진 효과 검정 ... 35
• 2) 작물 생장촉진 효과 검정 ... 36
• 나. 결과 및 고찰 ... 36
• 1) 발아촉진 효과 ... 36
• 2) 작물 생장촉진 효과 ... 38
• 3. 유용 미생물의 동정 ... 40
• 가. 재료 및 방법 ... 40
• 나. 결과 및 고찰 ... 40
• 4. Pseudomonas fluorescens 가 생산하는 siderophore의 특성 ... 46
• 가. 재료 및 방법 ... 46
• 나. 결과 및 고찰 ... 49
• 2절 배지 최적화 및 제제화 연구 ... 54
• 1. 소용량 발효조에서의 최적화 연구 ... 54
• 가. 재료 및 방법 ... 54
• 1) 당농도의 분석 ... 54
• 2) 균체농도 측정 ... 54
• 3) 생균수 측정 ... 54
• 4) 플라스크 최적 배양 조건 ... 54
• 5) 소용량 발효조(5L) 에서의 최적화 연구 ... 55
• 6) siderophore 생성량 측정 ... 55
• 나. 결과 및 고찰 ... 56
• 1) 플라스크 배양을 통한 배양 최적화 ... 56
• 가) 길항세균의 탄소원 조사 ... 56
• 나) 길항세균의 질소원 조사 ... 57
• 다) 길항세균의 미량 원소에 대한 영향 조사 ... 58
• 라) 탄소원 농도 변화에 따른 실험 ... 59
• 마) 질소원 농도 변화에 따른 실험 ... 60
• 바) 길항 세균의 pH에 따른 실험 ... 61
• 사) 길항 세균의 온도에 따른 실험 ... 62
• 아) 플라스크 조건에서 최대성장 배지 조성 ... 64
• 자) siderophore 생성 배지 조성 탐색 ... 65
• 차) siderophore 최대 생성배지 조건 ... 67
• 2) 5L 발효조 배양공정의 최적화 ... 68
• 2. 대용량 발효조에서의 최적화 연구 ... 69
• 가. Bacillus sp. BIG21003의 300L 및 2500L 발효조 최적화 연구 ... 69
• 1) 재료 및 방법 ... 69
• 가) 공시균주 및 보존 ... 69
• 나) 균체농도 측정 ... 70
• 다) 포도당 농도 측정 ... 70
• 라) 300L 및 2500L 발효조에서의 최적화 연구 ... 70
• 2) 결과 및 고찰 ... 70
• 가) 300 liter modified fedbatch culture공정 ... 70
• 나) 2500 liter modified fedbatch culture공정 ... 71
• 나. Pseudomonas fluorescens K95009의 300L 및 2500L 발효조 최적화 연구 ... 73
• 1) 재료 및 방법 ... 73
• 2) 결과 및 고찰 ... 73
• 가) 대용량 발효조(300L)의 대량생산 공정 연구 ... 73
• 나) 대용량 발효조(2500L)의 대량생산 공정 연구 ... 75
• 3절 미생물 안정적 제제개발 ... 78
• 1. Bacillus sp. BIG21003 균의 안정화 ... 78
• 가. 재료 및 방법 ... 78
• 1) Spray dry ... 78
• 2) Freeze dry ... 78
• 3) 경시 변화 ... 78
• 나. 결과 및 고찰 ... 78
• 2. Pseudomonas fluorescens K95009 균의 안정화 ... 81
• 가. 재료 및 방법 ... 81
• 나. 결과 및 고찰 ... 81
• 1) Freeze dry 방법을 통한 세포 안정화 ... 81
• 2) 흡착(adsorption)을 이용한 세포 안정화 ... 83
• 4절 주요 작물의 생리적 특성에 관한 연구 ... 85
• 1. 주요작물의 priming 조건 구명 ... 85
• 가. 공시재료 및 조사방법 ... 85
• 나. 결과 및 고찰 ... 87
• 1) 더덕 ... 87
• 2) 상추 ... 88
• 3) 양파 ... 92
• 4) 당근 ... 95
• 5) 담배 ... 98
• 5절 Seed pelleting 기술 개발 ... 102
• 1. Seed pelleting 성형 물질 선발 ... 102
• 가. 서언 ... 102
• 나. 재료 및 방법 ... 102
• 1) Seed pelleting 물질 선발 ... 102
• 가) 접착물질 선발 ... 102
• 나) 피복물질 선발 ... 103
• 2) 발아율 조사방법 ... 103
• 가) 접착물질 선발에 따른 발아율 ... 103
• 나) 피복물질 선발에 따른 발아율 ... 103
• 다. 결과 및 고찰 ... 104
• 1) 펠렛 피복·접착물질이 발아에 미치는 영향 ... 104
• 가) 접착물질이 발아에 미치는 영향 ... 104
• 나) 피복물질이 발아에 미치는 영향 ... 107
• 2. Seed pelleting 기술 개발 ... 109
• 가. 재료 및 방법 ... 109
• 1) 접착물질 slurry액의 제조 ... 109
• 2) 피복물질 powder의 제제화 ... 110
• 3) Pelleting 종자 제조 ... 110
• 4) Pelleting 종자의 물리적 특성 조사 ... 110
• 가) 피복재료 별 pellet 종자의 경도 및 균일도 측정 ... 110
• 나) pelleting 종자의 수분흡수력 측정 ... 110
• 5) Pelleting 종자의 발아율 ... 110
• 가) 피복물질조합에 따른 pelleting 종자의 발아율 ... 110
• 나) 토양함수량에 따른 pelleting 종자의 발아율 ... 111
• 6) Pelleting 종자 제조시 온도의 영향 ... 111
• 나. 결과 및 고찰 ... 112
• 1) Pelleting 종자의 제조 ... 112
• 2) Pelleting 종자의 발아율 ... 113
• 가) 피복물질조합에 따른 pelleting 종자의 발아율 ... 113
• 나) 토양함수율에 따른 pelleting 종자의 발아율 ... 114
• 3) pelleting seed의 물리적 특성 ... 117
• 가) 피복재료에 따른 pelleting 종자의 경도 및 균일도 측정 ... 117
• 나) pelleting 종자의 수분흡수력 측정 ... 120
• 4) Pelleting 종자 제조시 온도의 영향 ... 121
• 6절 미생물 pelleting 종자의 생장촉진 활성 검정 ... 123
• 1. 미생물 pelleting 종자의 제조 ... 123
• 가. 재료 및 방법 ... 123
• 1) 미생물 제제화 ... 123
• 2) 미생물 pelleting 종자 제조 ... 123
• 3) 미생물 pelleting 종자 활력 검정 ... 124
• 4) Priming 처리된 미생물 pelleting 종자의 활력검정 ... 124
• 나. 결과 및 고찰 ... 124
• 1) 미생물 pelleting 종자의 활력 검정 ... 124
• 2) Priming 처리된 미생물 pelleting 종자의 활력 검정 ... 126
• 2. 생육촉진 효과 검정 ... 128
• 가. 재료 및 방법 ... 128
• 나. 결과 및 고찰 ... 129
• 7절 미생물 pelleting 종자의 길항력 검정 ... 132
• 1. 미생물 종자 처리에 따른 균 생존력 검정 ... 132
• 가. 재료 및 방법 ... 132
• 1) Pelleting 성형물질을 이용한 미생물 coating ... 132
• 2) 미생물 pelleting 종자의 안정적 균 활력 유지 기술 ... 133
• 나. 결과 및 고찰 ... 133
• 1) Pelleting 성형물질을 이용한 미생물 coating 처리 ... 133
• 2) 미생물 pelleting 종자의 안정적 균 활력 유지 기술 ... 138
• 2. 미생물 pelleting 종자의 근권정착능력 ... 140
• 가. 재료 및 방법 ... 140
• 1) 공시 재료 ... 140
• 2) 미생물 pelleting 종자의 재배 기간에 따른 밀도변화 ... 140
• 3) 근권정착능력 검정 ... 141
• 4) 미생물 pelleting 종자의 병억제 효과 ... 141
• 나. 결과 및 고찰 ... 141
• 1) 균의 접종후 기간경과에 따른 밀도변화 ... 141
• 2) 근권 정착능력 ... 142
• 3) 미생물 pelleting 종자의 병억제 효과 ... 143
• 8절 농가 실증 포장실험 ... 146
• 1. 작물 생육 촉진 효과 ... 146
• 가. 서언 ... 146
• 나. 재료 및 방법 ... 146
• 1) 공시재료 ... 146
• 3) 포장 선정 및 정리 ... 147
• 다. 결과 및 고찰 ... 149
• 1) 초기 발아율 비교 ... 149
• 2) 온실 생육 비교 ... 149
• 3) 지역별 농가 실증 시험 ... 151
• 가) 실험포장의 물리·화학적 성질 ... 151
• 나) 포장 실험 기간 기상 변화 ... 152
• 다) 상추 지역별 field 생육촉진 효과 검증 ... 153
• 라) 양파 지역별 field 생육촉진 효과 검증 ... 157
• 2. 토양병에 대한 억제 효과 ... 163
• 가. 재료 및 방법 ... 163
• 1) 길항미생물 펠렛종자의 경시적 활력 조사 ... 163
• 2) 모잘록병 억제 효과 ... 163
• 나. 결과 및 고찰 ... 163
• 1) 길항미생물 pelleting 종자의 경시적 활력 변화 ... 163
• 2) 모잘록병 억제효과 ... 164
• 9절 생장촉진 물질의 성분 분석 및 성분 구명 ... 169
• 1. 생장촉진 물질의 성분 분석 및 성분 구명 ... 169
• 가. 재료 및 방법 ... 169
• 1) 공시균주 ... 169
• 2) 기기 및 시약 ... 169
• 3) 배지와 상등액 간의 HPLC 분석 ... 169
• 4) 추출 및 분획 ... 170
• 가) Pellet과 suspension의 추출 ... 170
• 나) 극성에 따른 순차적 용매 분석 ... 170
• 다) 분획층별 발아율 검사 ... 170
• 라) Column chromatography에 의한 생리활성 물질 분리 및 정제 ... 171
• 5) Crystal 분석 ... 172
• 가) crystal을 이용한 종자의 발아율 조사 ... 172
• 나) RI 분석 ... 172
• 다) 당 가수분해 ... 172
• 나. 결과 및 고찰 ... 172
• 1) 분획층별 발아율 검사 ... 172
• 2) 배지와 상등액간의 함량 비교 ... 179
• 3) 추출 및 분획에 따른 분획층별 함량 비교 ... 179
• 4) Amberlite XAD2 resin column chromatography ... 181
• 5) Thin Layer Chromatography ... 182
• 6) Silicagel column chromatography ... 182
• 7) Mass 및 NMR 분석 ... 184
• 8) Crystal을 이용한 생장촉진 실험 ... 188
• 9) RI 분석 ... 192
• 10) 당 추정 분석 ... 193
• 10절 시제품 개발 ... 194
• 1. 서언 ... 194
• 2. 시제품 제조 ... 194
• 가. 재료 및 방법 ... 194
• 나. 결과 및 고찰 ... 195
• 1) 상추 미생물 pelleting 종자 제조 ... 195
• 2) 양파 미생물 pelleting 종자 제조 ... 196
• 3. 미생물 펠렛종자 시제품 ... 197
• 가. Pelleting 종자와 나종자 비교 ... 197
• 나. 시제품 바이오캡스(BioCaps) ... 198
• 4장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 200
• 1. 목표 달성도 ... 200
• 5장 연구개발결과의 활용계획 ... 202
• 6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학 기술정보 ... 203
• 1. 근권세균의 냄새가 식물성장 촉진(독일) ... 203
• 2. 제지 부산물로 토양병 방제(미국) ... 204
• 3. 천연물 유래의 환경친화적 식물성장조절제 개발(일본) ... 205
• 4. Siderophore 분비 미생물 비료(인도) ... 206
• 5) Pseudomonas putida의 게놈 완전 해독(독일) ... 207
• Reference ... 208
• 끝페이지 ... 213