초록 ▼

○ 연구결과
Ⅰ. 복제수정란의 제작과 생존율 향상
(1) 복제수정란 생산 확립
·체외 성숙 시간 18-21시간째의 난자를 2.6kv/cm의 전기자극을 두 번 주었을 때 가장 높은 융합율과 분할율을 나타냄.
·ionomycin과 6-DMAP 공동처리군에서 높은 분할율을 나타냄, 6-DMAP만 처리할 경우 3시간째가 가장 높은 분할율을 나타냄.
·Cytochalasin B를 3시간 처리한 결과 극체의 방출을 억제하였고, 발달에 영향을 미치지 않음.
(2) 여러 체세포에 의한 복제수정란 생산조건 확립

○ 연구결과
Ⅰ. 복제수정란의 제작과 생존율 향상
(1) 복제수정란 생산 확립
·체외 성숙 시간 18-21시간째의 난자를 2.6kv/cm의 전기자극을 두 번 주었을 때 가장 높은 융합율과 분할율을 나타냄.
·ionomycin과 6-DMAP 공동처리군에서 높은 분할율을 나타냄, 6-DMAP만 처리할 경우 3시간째가 가장 높은 분할율을 나타냄.
·Cytochalasin B를 3시간 처리한 결과 극체의 방출을 억제하였고, 발달에 영향을 미치지 않음.
(2) 여러 체세포에 의한 복제수정란 생산조건 확립
·체외배양, 냉동 해동, 신선한 난구세포는 핵치환에 이용이 가능, 냉동 해동한 난구세포는 발달율을 떨어뜨림. 난구세포와 공배양을 실시한 경우와 1 mM의 glutathion을 첨가한 배지에서 배반포까지의 발달률이 높아짐.
·태아세포, 난구세포, 귀 상피세포를 이용하여 핵치환된 복제수정란의 발달은 유의적인 차이가 없음. 밀집 배양한 공여세포, 냉각한 공여세포와 공여세포를 동결 융해한 후 배양하는 과정없이 소의 핵치환기법에 이용하였을 때 동결융해한 세포가 발달율이 낮았으나 세포예정사 비율은 차이가 나지 않음.
Ⅱ. 우량 복제수정란의 선별과 보존
(1) 복제수정란 평가를 위한 형태학적 비교분석기술 개발
·체외 성숙시킨 소의 난자에 핵을 제거하고, 미세주입방법을 이용하여 난구세포 핵치환을 실시한 후 핵과 미세섬유 및 미세소관의 형성 및 변화를 조사한 결과, 핵치환 후 난자내 도입된 난구세포핵은 핵막파괴와 함께 난자 내 여려 요소에 노출됨으로써 premature chromosome condensation을 겪게 되는 것으로 보이며, 이후 다시 팽윤되며 잠시동안 재응축을 거친 후 전핵을 형성하고, 정상적으로 유사분열을 겪게 된다. 또한 이러한 핵의 변화에 따른 미세소관과 미세섬유의 변화도 관찰하였다. 난구세포핵의 도입 직후 핵 주위에 미세소관층이 밀집되어 있음이 관찰되었다. 전핵이 형성된 이후에는 두극의 방추사를 형성하여 정상적인 유사분열을 유도하는데, 이는 정상적인 체외수정, 난자내 정자직접주입, 난자내 정자두부주입 이후에서도 동일한 형태를 보였다. 그리고 전핵 주위로 형성되지 않는 비정상적인 형태의 미세섬유가 많이 관찰되었다. 결론적으로 이 연구결과들은 소 난자의 미세주입법을 이용한 핵치환 이후에 핵과 미세소관이 정상적으로 remodeling 될 수 있음을 보여주고 있다.
·핵치환 이후 착상 전 단계까지의 배 발달과정에서 공여세포에서 유래된 mitochondria 및 mitochondrial DNA(mtDNA)의 운명을 난구세포를 공여세포로 사용하여 공여세포의 mitochondria의 운명을 평가하기 위해 MitoTracker Green FM flurochrome 으로 염색된 난구세포를 핵이 제거된 성숙난자에 미세주입에 의해 핵치환을 실시하여 조사하였다. 그 결과 공여세포에 MitoTracker의 염색은 핵치환 이후 배 발달의 저해 효과는 나타나지 않았으며, 분할율은 69%(56/81), 배반포까지의 발달율은 6.2%(5/81)로 관찰되었다. 공여세포의 mitochondria의 핵치환 이후 세포질로 퍼져나가 분할 이후 각 할구에 무작위 적으로 분포되었다. 이 형광은 8에서 15-세포기 까지 관찰이 됐으며 이 사이의 형광을 관찰할 수 있는 난자의 수는 25%(5/20)였다. 그러나 16-세포기 이후에는 공여세포의 mitochondria를 감지할 수 없었다. 대조군으로 1-세포기에 발달 정지된 난자가 배반포가 형성되는 7일 째에도 형광을 나타내는 것으로 유추하면 형광의 퇴색에 의해 공여세포 mitochondria가 감지되지 못한 것이 아님을 알 수 있다.
·핵치환 이후의 공여세포의 mtDNA의 운명을 알아보기 위해 Allele-specfic PCR(AS-PCR)방법과 직접 염기서열 분석, chromatography를 이용하여 분석한 결과, 소에서 핵치환 이후 공여세포 유래의 mtDNA는 적어도 배반포까지 유지
(2) 복제수정란의 생사감별 및 등급판정
·체외수정과 핵치환 유래 소 배반포에서 apoptosis 조절 유전자로써 Bcl-2 와 Bax 유전자의 전사체 발현량을 비교 조사한 결과, 핵치환 유래 배반포에 있어 TUNEL 표식으로 확인된 비율은 체외수정된 배반포보다 유의하게 높다. 체외수정된 배반포의 Bcl-2의 발현양은 핵치환유래 배반포보다 높다. 반대로 체외수정된 배반포의 Bax 발현양은 핵치환 유래 소 배반포 보다 낮았다.
·핵치환된 소난자의 배발달 비교와 peri-implantation 단계에서 Oct4와 FGF4 유전자의 상관관계를 조사한 결과, 체외수정란의 경우 peri-implantation 단계에서는 Oct4의 발현이 증가되면서 FGF4의 발현이 비례적으로 증가되었다. 그러나 핵치환 유래된 부화 배반포에서는 Oct4의 발현이 IVF와 비교 했을때 높게 발현되는 양상을 보였으며, FGF4 또한 체외수정 유래의 부화 배반포와 outgrowth 단계보다 낮게 발현되는 비정상적인 양상을 확인하였다.
(3) 복제수정란의 최적의 동결조건 확립
·복제수정란과 체외수정란 유래 난자를 EM grid, straw와 cryo-loop를 이용하여 동결융해 후 발달율을 조사한 결과 복제수정란이 체외수정란 유래 난자에 비교하여 현저하게 낮은 생존율을 보였으며, 단지 복제수정란은 cryo-loop에서만 생존하였다.
·복제수정란의 동결보존을 위한 새로운 동결용기 개발을 위해서 체외수정란 유래 난자를 EM grid, straw와 paper를 이용하여 동결융해 후 발달율을 조사한 결과 동결융해 후 paper를 동결용기로 이용하였을 경우 가장 높은 생존율을 보임으로써, 단지 난자동결을 위한 새로운 용기를 개발할 수 있었다.
·융해후 Hsp 70의 위치와 발현량을 조사한 결과는 동결 융해하기 전 2-세포기, 8-세포기 단계의 난자는 세포질 내에 Hsp 70의 발현이 분배되어 있지만, 동결 융해 후는 세포질 내에 발현량이 일정한 곳에 집중되어 있었다. 그러나 배반포 단계에서는 동결 융해 후 Hsp 70의 발현이 분배되어 있었다.
Ⅲ. 복제수정란의 현장이식
(1) 복제수정란 현장 이식 검증
·공여세포로서 밀집 배양한 체세포, 냉각한 체세포와 공여세포를 동결 융해한 후 배양하는 과정없이 핵치환한 복제수정란 유래의 배반포를 수란우에 이식한 결과, 배양한 세포, 동결융해한 세포, 저온처리한 세포를 사용한 경우에 있어서, 각각 30일째 17, 1, 3마리에서 임신여부가 확인이 되었다. 이후의 발달에 있어서 90일 이후로 임신을 유지한 경우는 각각 6, 0, 1마리이며, 현재까지 배양된 세포를 공여세포로 이용한 경우 이후 180일째 까지 임신상태를 유지한 경우, 3마리 중 2마리는 240일경 유산 되었으며, 한 마리는 태어났지만 사산이었다.
Ⅳ. 복제소의 생산율 향상을 위한 기술 개발
(1) 전기자극의 융합조건에 따른 칡소 핵이식배의 생산
·전압이나 전기자극 시간에 따른 융합율은 자극 시간이 길수록 낮았으며, 전압이 높은 경우에도 낮은 융합율을 보였다. 한편 전기자극 후 난자가 용해되는 비율은 전기자극 시간이 길수록 높았으며, 또한 높은 전압일수록 배가 용해되는 비율이 높아지는 경향을 보였다.
·전압이나 전기자극 시간에 따른 핵이식 배의 2세포기로의 발달율은 전기자극 시간이 낮을수록 다소 높으나 별다른 차이는 없었다. 배반포로의 발달은 2.1kV를 제외하고는 전기자극 시간이 길수록 높은 발달율을 보였다. 2.1kV의 경우에서만 짧은 전기자극 시간에서 높은 배반포기로의 발달율을 보였다.
·한우의 경우 전기자극 시간에 따른 융합율의 차이는 없는 것으로 나타났으나, 배의 용해율은 전기자극 시간이 긴 처리군에서 높은 것으로 나타났다.
·핵이식 배의 2세포기로의 발달율은 전기자극 시간이 짧은 처리군에서 다소 높은 경향을 보였으나, 배반포기로의 발달율은 두 처리군 간에 차이가 없었다.
(2) 활성화 처리 후 핵이식배의 핵상변화
·활성화 처리 후 1시간이 경과하면서 55%의 난자에서 핵이 비대해지기 시작하였고, 이후 9시간이 경과하였을 때에는 90%의 핵이식배에서 전핵의 형성되었다.
(3) 배양체계에 따른 소 핵이식배의 발달율 비교
·단순배지보다 cumulus cell과의 공배양을 실시 하였을 경우, 2세포기로의 발달율은 단순배지 처리군에서 다소 높은 경향을 보였으나, 배반포기로의 발달은 공배양을 실시한 군에서 아주 높게 나타났고, 공배양군에서 배반포기의 세포수가 훨씬 많았다.
·세포주기 동기화에 따른 핵이식배의 발달율에서 처리군이나 비처리군에서 융합율, 2세포기로의 발달율 및 배반포기로의 발달율 모두 두 군간에 차이가 없었다.
·배반포기로 발달한 핵이식배의 동결융해 후의 생존율은 단순배지에서 배양한 군에서보다 난구세포와 공배양 한 군에서 높은 생존율을 보였다.
·동결융해 후 생존한 배반포 배의 부화율은 난구세포와 공배양 한 군이 단순배지에서 배양한 군보다 높은 부화율을 보였다.
·동결직전에 인위적으로 배반포강을 제거해 준 처리군의 생존율이 비처리군에 비하여 높은 생존율을 보였다.
(4) 핵이식배의 염색체 분석
·10회 미만을 계대배양한 공여핵에서는 염색체 이상이 30%를 넘지 않았으나, 15회까지 계대배양한 공여핵을 사용한 핵이식배에서는 거의 절반의 난자에서 염색체 수의 이상이 확인되었다.
·핵이식배에서 비정상적인 염색체 숫자를 가진 난자가 체외수정란 보다 다소 높은 경향을 보였으나 그 차이는 거의 없는 것으로 보였다.
·8세포기의 핵이식배와 배반포기 핵이식배간에 염색체 이상을 가진 난자는 두군 모두에서 10% 미만으로 차이가 없었다.
(5) 공여세포의 계대수가 핵이식배의 발달에 미치는 영향
·5회 미만의 계대수를 가진 공여핵을 사용하였을 경우 2세포기로의 발달율은 6-10회까지 계대한 공여핵을 사용한 경우와 차이를 보이지 않았으나, 배반포기로의 발달은 6-10회까지 계대한 공여핵을 사용한 군에서 더 높은 발달율을 보였다.
·6-10회까지 계대한 공여핵을 사용한 배반포기 난자가 5회 미만의 계대수를 가진 공여핵을 사용하여 얻은 배반포기 난자보다 상당히 많은 세포수를 가지고 있었다.
(6) 핵이식배의 apoptosis 연구
·Turnel 방법을 이용한 체외수정란과 핵이식배의 apoptosis를 비교한 결과 두군간의 apoptosis 발생율은 차이가 없었다.
(7) 소 핵이식배의 수태율
·소의 난관상피세포와 함께 핵이식배를 공배양한 처리군에서 단순배지만을 사용하여 배양한 처리군 보다 높은 수태율을 보이는 경향이 있다. 하지만 두 처리군간에 큰 차이는 나타나지 않았다.
·태아섬유아 세포 (fetal fibroblast cell)를 공여세포로 이용한 군에서 칡소의 귀세포를 공여세포로 이용한 군보다 높은 수태율을 보였다.
·핵이식배를 임신한 7마리의 소에서 2마리가 90일 이전에 유산을 하였으며, 90-150일 사이에 유산한 소는 3마리였고, 150일 이후에 유산한 소는 1마리였다.
·체외수정란과 핵이식배간에 조기 배사멸의 유형이 전혀 다른 양상을 보였다. 체외수정란의 경우 P4 농도가 3ng/㎖ 이상일 때 배사멸율이 높았으나, 핵이식배의 경우는 1ng/㎖ 미만일때 조기 배사멸율이 높았다.
·비임신군의 경우 이식후 7일령에 P4의 농도가 2ng/ml 이하로 나타난 반면, 임신군의 경우 P4의 농도가 2ng/ml 이상으로 지속적으로 유지되었다.
·IGF-1 농도는 비임신우의 경우 이식일로부터 지속적으로 감소하는 경향을 보였으나, 임신우의 경우 이식일부터 감소하다가 40일령 이후 증가하는 추세를 보였다가 이후 다시 감소하는 추세를 나타내었다.
(8) 복제송아지의 체중 비교
·출생시의 체중을 비교하면 체외수정송아지와 복제송아지 사이에는 차이가 나타나지 않았다. 하지만 사산한 복제송아지의 경우에는 체외수정송아지나 복제송아지보다 다소 체중이 높은 것으로 나타났다.
·복제송아지의 쌍태의 경우, 단태와 비교하여 생시체중이 평균 10kg 정도 낮게 태어났다.
(9) 복제송아지의 혈액 분석
·태어났을 당시의 혈액을 비교 분석한 결과, 복제송아지와 체외수정송아지 간에 유의한 차이를 보이지 않았으나, 사산한 복제송아지의 경우, 산자에 비하여 상대적으로 백혈구와 HCT의 수치가 매우 낮게 나타났다.
·복제송아지와 체외수정송아지의 혈액을 생시부터 생후 56까지 2주 간격으로 채취하여 성분을 분석한 결과, 두 군간에 혈액성분의 차이는 나타나지 않았다.
·복제송아지의 혈액내 glucose 농도를 일반한우송아지와 비교한 결과 전체적으로 수치가 다소 낮은 경향을 보였다. 또한 insulin의 경우 일반한우송아지에 비하여 변화의 폭이 크게 나타나는 경향을 나타내었다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results and Suggestions for Applications
1. Results
A. 1st detail subject : Increase of survival rates and production of cloned embryo
○ Production of cloned embryo
- Cloned embryos produced by enucleated oocytes 18-21 hour after in vitro maturation with somtic cells by electrofused b

Ⅳ. Results and Suggestions for Applications
1. Results
A. 1st detail subject : Increase of survival rates and production of cloned embryo
○ Production of cloned embryo
- Cloned embryos produced by enucleated oocytes 18-21 hour after in vitro maturation with somtic cells by electrofused by two pulse of 2.6 KV/cm were higher fusion and cleavage rates.
- A significant in improvement of activation efficiency was observed after ionomycin followed by 2 mM 6-DMAP treatment for 3 hour which was enough time for the activation of reconstructed bovine embryos.
- There was no formation of polar body in reconstructed oocytes after nuclear transfer both in control and CB treated groups. The effect of CB on development of bovine reconstructed embryo is negligible
- There is no difference the development to blastocyst of cloned embryos comparison with in vitro fertilization embryos and parthenotes.
○ Production of cloned embryos with various somatic cells
- Dimeter of fresh and cultured cumulus cell was 9.46 ± 1.66 and 13.95 ± 1.42 ㎛, respectively, which chowing the diameter of cumulus cells was enlarged by culture. Although fronzen-thawd cumulus cells could be used as donor cell for nuclear transfer, the developmental potential of frozen-thawed cultured cell significantly depressed to the blastocyst stage compared to that of fresh cell.
- Blastocyst formation rate was improved after culture in medium layered with cumulus cells and medium supplemented with 1 mM glutathione.
- There is no difference in blastocyst formation rate following NT with fetal fibroblast cell, cumulus cell and ear cell.
- This study was designed to investigate the in vitro developmental ability and apoptosis of bovine embryos nuclear transferred (NT) with frozen-thawed or cooled donor cells. Cultured adult bovine ear cells were used as donor cells cultured to confluence (CC) or cooling to 4℃ for 48 hrs, after confluent culture or after freezing-thawing (FT). The blastocysts rates of NT embryos derived from CC and FT cells were significantly different. However, interestingly the rate of apoptosis in NT blastocysts was not significantly different when produced by using FT cells than CC or cooled cells as donor cells. In conclusion, the use of CC and cooled cells as donor cells showed no significantly different developmental rate whereas FT cells resulted in significantly different developmental rate. CC, FT and cooled cells did not increases the apoptosis rate of NT embryos.
B. 2nd detail subject : Selection and conservation of superiority cloned embryo
○ Morphological comparative analysis engineering development for valuation of cloned embryo
- The nuclear remodeling patterns, microfilament and microtubule configurations in nuclear transfer embryos were examined after nuclear transplantation by cumulus cell. Within 1 h after the cumulus cell injection, enlarged nucleus in nuclear transfer embryos was observed and chromosomes were prematurely condensed at 2 h after injection. At 4 h after injection, pseudo-pronucleus firstly appeared. Dense microtubule network formed around the nucleus shortly after microinjection. At the pronucleus stage, the formation of microtubule network around pseudo-pronuclei was also observed.
At mitosis, microtubule dynamics were similar to those obtained from normal fertilization. Once forming a pronucleus, the embryos reconstructed by nuclear transfer could induce changes in microtubules similar to those observed in IVF, ICSI and ICSHI. however, abnormal microfilament assembly was frequently observed in nuclear transfer bovine embryo. The present study examined the formation of pseudo-pronucleus, microfilament and microtubule formation around nuclei following nuclear transfer. These results indicate that the reconstructed embryos are effectively activated and have developmental potential, and that the microtubule can be remodeled in association with donor nuclei within nuclear transferred bovine oocytes.
- The developmental potential of reconstructed embryos and the fate of donor mitochondria and mitochondrial DNA were examined during preimplantation development after nuclear transfer in cattle. To evaluate the fate of donor mitochondria, donor cells labelled with MitoTracker Green FM fluorochrome were injected into enucleated bovine MII oocytes and cultured in vitro.
MitoTrackere labelling on donor cells did not have a detrimental effect on blastocyst formation following nuclear transfer. The cleavage rate was 69% (56/81) and blastocyst formation rate was 6.2% (5/8) at 7 days after nuclear transfer. The labelled mitochondria dispersed to the cytoplasm abd became distributed between blastomeres and could be identified up to the 8 to 15 cell stage. Small patches of mitochondria were detected in some 8 to 15 cell stage embryos (5/20). However, donor mitochondria were not detected in embryos at the 16 cell stage and subsequent developmental stages. In the control group, mitochondria could be identified in arrested 1 cell embryos up to 7 days after nuclear transfer.
- Mitochondrial DNA heteroplasmy in the nuclear transfer embryos were analysed by Allel-specific PCR (AS-PCR) and direct sequencing methods.
AS-PCR analysis for detection of donor mitochondrial DNA was performed at the 1-cell, 2-cell, 4-cell, 8-cell, 16-cell, morula and blastocyst stages of embryo. The mitochondrial DNA from donor cells were detected in all of the developmental stages of nuclear transfer embryos. To confirm the mtDNA heteroplasmy in cloned embryos. AS-PCR product from nuclear transfer-derived blastocyst was analysed by DNA sequencing and DNA chromatography. These resultes indicates that foreign cytoplasmic genome from donor cells was not destroyed by cytoplasmic event during nuclear transfer.
○ Evaluation of live or dead and decision of grade of cloned embryo
- This study was to investigate the apoptotic rates in bovine blastocyst derived from in vitro fertilization (IVF) and nuclear transfer (NT). In addition, the expression levels of Bcl-2 and Bax gene were investigated in the blastocyst to confirm their potential roles in the regulation of apoptosis during preimplantation embryonic development. The proportion of TUNEL positive signal in blastocyst derived from NT is significantly higher than that in blastocyst derived from IVF. Bcl-2 expression level of blastocyst derived from IVF was higher than that of blstocyst derived from NT.
However, High expression level of Bax was observed in blastocyst derived from NT.
- This study was carried out to investigate the developmental rates of embryo reconstructed with different cell type and to estimate correlation of transcriptional level of octamer-binding transcription factor4 (Oct4) and fibroblast growth factor4 (FGF4) gene on peri-implantation stage embryos.
In peri-implantation of IVF result in a transient increased of FGF4 paralleled by an increased expression of Oct4. However, Oct4 gene was highly expressed in hatching blastocysts derived from NT compared to IVF. Also, FGF4 expression level in hatching blastocysts and outgrowth stage derived from NT was lower than that of IVF.
○ Establishment of cryopreservation condition of cloned embryo
- There were no differences in the survival rates of IVF using EM grid, cryo-loop. However, survival rates by straw were relatively lower than other containers. Only, nuclear transferred embryos survived by using cryo-loop.
- This study was to establish an effective cryopreservation method and virus vitrification containers. However, according to their result, even if the thermal conductivity of paper is still less than grid, paper has a similar record compared with grid. The container for the vitrification plays an important part in freezing as a container for embryos, rather than it affects the survival of embryos.
- Effects of elevated in vitro temperature on in vitro produced bovine embryos were analysed in order to determine its impact on the expression of heat shock protein 70 (HSP70) by control and frozen-thawed after in vitro fertilization (IVF) or nuclear transfer (NT). Results revealed the expression of hsp 70 mRNA were higher thawed embryos than control embryos.
Immunocytochemistry used to localize the hsp70 protein in embryos. Two, 8-cell embryos derived under control condition was evenly distributed in the cytoplasm but appeared as aggregates in some embryos exposed frozen-thawed. However, under control condition, blastocysts displayed aggregate signal while Hsp70 in frozen-thawed blastocysts appeared to be more uniform in distribution.
C. 1st coordinated subject : Transfer of cloned embryo
○ Embryos transfer of cloned embryo
- Bovine blastocysts derived from embryos nuclear transferred (NT) with confluent culture, frozen-thawed or cooled donor cells transferred into recipients. The pregnancy of each 17, 1, and 3 recipients became confirmation after 30 day. There is to advancement of after and the case which maintains a pregnancy with 90 day after each 6, 0, and 1 recipients. Until the case after 180 days which use the cell which is confluent cultivated cell the case which maintains a pregnancy condition, 2 middle-school 3 miscarried around 240 days, one was the stillbirth which is born but.
D. 2nd coordinated subject : Development technique for increase of productive efficiency of cloned bovine
○ The production of cloned embryos produced from ear cell of brindle coated Hanwoo
- The fusion rates of cloned embryos produced from ear cells of brindle coated Hanwoo according to stimulation conditions : The fusion rates were affected from voltage and stimulation time. Using higher voltage and longer stimulation time, it showed lower fusion rates. The increased lysis rate after stimulation was higher in longer stimulation time and higher voltage groups, respectively.
- The development rates of cloned embryos produced from ear cells of brindle coated Hanwoo according to stimulation conditions : The cleavage rate of fused embryos increased when the stimulation time was longer, but the differences were not significant. However, the development rate of cloned embryos developed to blastocyst was increased significantly when the stimulation time was longer, except for 2.1 kV treated group. Only in 2.1 kV group, the group treated with short time showed higher development rates.
- The fusion rates of cloned embryos produced from fetal fibroblast cells of Hanwoo according to stimulation conditions : The differences of fusion rates were not different in both stimulation time groups, however, the lysis rate was increased in longer stimulation time group.
- The development rates of cloned embryos produced from fetal fibroblast cells of Hanwoo according to stimulation conditions : The higher cleavage rate of fused embryos showed in short stimulation time group. The development rate of cloned embryos developed to blastocyst showed no difference between two groups.
○ Nuclear status of cloned embryos after activation
- 55% of the cloned embryos produced from bovine fetal fibroblast cells exchanged to enlarge and pronucleus (PN) 1hr after activation, and more than 90%of cloned embryos showed the formation of PN 9hr after activation.
○ The development rate of cloned embryos according to culture systems
- The development rate of cloned embryos according to co-culture system : The cleavage rate of fused embryos was high in the group cultured with CR1aa medium, however, the developmental rate of cloned embryos developed to blastocyst was increased significantly in the group cultured with cumulus cells. The cell number of blastocyst in co-culture group was a higher than the group cultured with CR1aa medium.
- The development rate of cloned embryos according to cell cycle synchronization method : There were no differences among fusion, cleavage and developmental rates between confluent and starved cell cycle synchronization methods.
- The survival rates of nuclear transferred blastocysts after frozen-thawing : It showed higher survival rates of frozen-thawed blastocysts in the group cultured with cumulus cells compared to the group cultured with CR1aa medium.
- The hatching rates of nuclear transferred blastocysts after frozen-thawing : The hatching rates of the blastocyst cultured with culumus cells were higher than the rates of the blastocyst cultured with CR1aa medium.
- The survival rates of frozen-thawed blastoysts using assisted hatching : The survival rates of frozen-thawed blastocysts in the group induced to removal of blastocoele immediately before cryopreservation were significantly higher than the group without pretreatment.
○ Chromosomal analysis of cloned embryos
- Chromosome analysis of donor fibroblast cells at different passages : The chromosomal abnormality of donor cells was increased after 15 passages compare to less than 10 passages. After 10 passages, it showed 45% of chromosomal abnormality.
- Chromosome analysis of embryos produced by IVF or NT : The chromosomal abnormality was slightly higher in NT group than in IVF group. However, the difference was not significant.
- Chromosome analysis of cloned embryos : There were no differences according to cell stages of cloned embryos.
○ The development of cloned embryos according to different passages of donor cells
- Effects of passages of donor fibroblast cells on the development of cloned embryos : The cleavage rate of cloned embryos produced by fibroblast cells was not different between 1-5 and 6-10 passages, and also the development rate of cloned embryos developed to blastocyst in 1-5 passages group was similar to those of 6-10 group.
- Effects of donor fibroblast cell passages on the cell number of blastocyst produced by NT : The cell number of blastocyst in 1-5 passages of donor cell group was lower than those of 6-10 passages group.
○ Apoptosis of nuclear transferred embryos
- TUNEL assay on embryos produced by IVF and NT : Apoptosis rate of cloned embryos was similar to that of embryos produced by IVF using TUNEL assay. Apoptosis rate was less than 6%.
○ Pregnancy rate after transfer of cloned embryos
- Effects of culture methods on the pregnancy : The higher pregnancy rate was obtained from the blastocyst cultured with bovine oviductal epithelial cells than the group cultured without co-culture cells. However, the difference was not significant.
- Effects of donor cell types on the pregnancy : The pregnancy rate of the group using fetal fibroblast cells of Hanwoo as donor cells was significantly higher than those of the group using ear cells of brindle coated Hanwoo.
- Abortion timing of cloned embryos or fetus produced by NT : Among 7 pregnant cows, 2 cows were aborted before 90 days, 3 of those were aborted between 91 to 150 days and 1 cow was aborted after 150 days.
- Early embryonic death or pregnancy rates on the concentration of progesterone (P4) : In IVF group, the early embryonic death was increased when the concentration of P4 was over than 3ng/㎖, however, it was increase when the concentration of P4 was less than 1ng/㎖ in the early embryonic death of NT group.
- Comparison of P4 concentration between non-pregnant and pregnant cows : In non-pregnant group, the concentration of P4 showed increasing pattern from embryo transfer to 28days after transfer, however, there was no expression pattern of P4 in pregnant group
- Comparison of a periodic IGF-1 concentration between pregnant and non-pregnant cows : The concentration of IGF-1 showed a decreasing tendency after embryo transfer and maintained lower levels in both pregnant and non-pregnant groups.
○ Birth weight of cloned calf
- Comparison of birth weight between calves produced from IVF and NT : The birth weight of calves was not different between IVF and NT groups.
However, the weight of claves dead at birth was higher than live birth calves.
- Comparison of birth weight between single and twin cloned calves : The birth weight of twin group was 10kg less than that of single group.
○ Blood analysis of cloned calves
- Blood compositions of calves produced from IVF and NT at birth : There were do differences between IVF and NT calves in blood compositions at birth, however, the level of WBC and HCT of cloned calves dead at birth showed lower level than those of live births.
- Comparison of blood compositions according to time period : There were no differences between normal and cloned calves in the compositions of blood samples collected a every other week from birth to 56days.
- Analysis of the concentration of glucose and insulin in blood : The concentration of glucose in cloned calf group was lower than that of normal calf group. The variation of the insulin concentration in cloned calf group was bigger than that of normal calf group.
○ Loicalization of Dnmt1 in embryos produced from IVF and NT
- In 2- to 4- cell stage embryos, Dnmt1 was expressed in cytoplasm, but at 8-cell stage, it was present only in the nucleus. By the blastocyst stage, Dnmt1 is found in the cytoplasm again.
○ Microsatellite loci analysis
- Genetic identity among the fibroblast cell and cloned calf was determined by microsatellite analysis, which also permitted the exclusion of the recipient as the genetic mother of the cloned calf. Based on these results, it showed that the donor fibroblast cells and cloned calf have an exactly same microsatellite DNA regions. It could be concluded that this is the cloned calf produced from donor fibroblast cells.
2. Proposition for Research, Developmental and Application of the Results
The results and the technologies derived from our study might be applied in the various following areas, and can be opened in public including scientific meetings and also should be followed in similar studies in the future.
○ Mass production field of superiority cow cloned embryo
· The part of improve pregnancy ratio technic background due to the sort of the fine cloned egg
· Preparation of improvement program which is optimum fertilized egg sorting for embryos transfer at field
· The technical part of bank system background for the large quantity supply of the cloned egg
· The fundamental research area of regarding the fertilization, an development, a differentiation and a physiological principle of the mammalian
· The technical part of diagnosis at early stage about embryonic mortality and abortion
· The research part of investigation which is continuous with embryo and embryonic mortality at early stage
· The technical part of minimized outbreak considering the abortion times and embryonic mortality at early stage
· Research and industry part of massive clone production system of transgenic embryo
· This technique transfer domestic other agency or industrial enterprise and about human skill training material

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 17
• CONTENTS ... 36
• 목차 ... 37
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 38
• 제1절 연구개발의 목적 ... 38
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 38
• 1) 기술적 측면 ... 38
• 2) 경제·산업적 측면 ... 39
• 3) 사회·문화적 측면 ... 39
• 제3절 연구개발의 범위 ... 40
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 42
• 제 1 절. 국내․외 관련기술의 현황 및 문제점 ... 42
• 가) 국외의 관련기술 현황 ... 42
• 나) 국내의 관련기술 현황 ... 44
• 제2절 앞으로의 전망 ... 44
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 45
• 제1절 연구개발 수행내용 ... 45
• 1. 난자의 회수 및 체외성숙 유도 ... 45
• 2. 공핵세포의 준비 ... 45
• 3. 소 난자의 핵치환 ... 46
• 4. 복제수정란의 난활성 및 체외배양 ... 46
• 5. 세포수 산정을 위한 수정란의 염색 ... 47
• 6. Immunolocalization 과 염색질, 미세섬유, 미세소관의 현미경검사 ... 47
• 7. PCR and sequencing of mitochondrial D-loop region ... 48
• 8. AS-PCR and oligonucleotides ... 48
• 9. Direct PCR and AS-PCR product sequencing (DNA chromatography) ... 48
• 10. RNA 추출 ... 49
• 11. RT-PCR ... 49
• 12. 핵이식란의 염색체 분석 ... 50
• 13. Tunnel assay ... 50
• 14. 난자의 핵성숙과 세포질 성숙의 확인 ... 51
• 15. 복제수정란의 최적 동결·융해 ... 51
• 16. 복제수정란의 이식 및 임신진단 ... 52
• 17. 복제 송아지 친자 감별법 ... 53
• 18. 통계처리 ... 54
• 제2절 연구결과 ... 55
• 1. 복제수정란의 제작과 생존율 향상 (제 1세부과제) ... 55
• 2. 우량 복제수정란의 선별과 보존 (제2세부과제) ... 68
• 3. 복제수정란의 현장이식 (제1협동과제) ... 95
• 4. 복제소 생산율 향상을 위한 기술개발 (제2협동과제) ... 97
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 122
• 제1절 연구개발의 목표 달성도 ... 122
• 제2절 대외 기여도 ... 123
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 124
• 제6장 참고문헌 ... 126
• 끝페이지 ... 139