초록

○ 연구결과
제주자생 아열대성식물에서 세제용 프로테아제의 추출 및 그로마토그래피법에 의한 정제에 성공하였으며, 조효소를 이용한 황산암모늄 침전법을 이용하여 고효율의 세제용 프로테아제 대량생산 시스템을 확립하였다. 또한 프로테아제를 다량함유하고 있는 제주자생 문주란의 대량 재배기술을 체계화 하여 세제용 프로테아제 대량생산을 위한 대량재배기술을 확립하였다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results of the Research
Chapter 1. Investigation of growing condition for suitable native subtropical plant
Among the Jeju native plants, the ones (Opuntia ficus-indica var. saboten, Canavalia lineata, Piper kadzura, Arisaema amurense var. serratum, Zingiber mioga) having high growth rate a

Ⅳ. Results of the Research
Chapter 1. Investigation of growing condition for suitable native subtropical plant
Among the Jeju native plants, the ones (Opuntia ficus-indica var. saboten, Canavalia lineata, Piper kadzura, Arisaema amurense var. serratum, Zingiber mioga) having high growth rate and adoptability were subjected to screen the protease activity.
Extracts from some of this candidate plant showed the gelatin degrading activity. The best activity was from plant code name the CAJ (after patent registration real name will be informed). It showed good stability in wide range of temperature (20 ∼ 70℃) and pH(4 ∼ 11).
Chapter 2. Investigation of growing condition for suitable native subtropical plant
CAJ was found in wide aera from sea level to high altitude (400m from sea level). The environmental conditions such as physico-chemical properties of soil, seasonal change of day light, relative humidity and temperature of habitat were investigated. The Fv/Fm meaning ability of the photosynthesis was around 0.8 in summer, below 0.8 in winter which will affect the growth. The properties of soil such as (bulk density, porosity, air-filled porosity ) were varied.
The seeds (50,000) of CAJ was collected from natural habitat and used for mass cultivation. The adaptation was carried out in the experimental form in cheju national university in field and in green house. The 발아율은 in habitat was better compared to general soil.
Chapter 3. Development of mass production technique for protease.
We develop the partial purification methods using extraction, centrifugation, dialysis. For further purification the size exclusion chromatography was employed.
The purity of the protease was checked by SDS-PAGE and after final size exclusion chromatography the protease band was the major band but few of residual band were detected. The protease band in SDS-PAGE showed the 60kD but in size exclusion chromatography showed the 240 kD which suggested that the protease in native condition act as tetramer.
This protease maintained its activity for long time in room temperature and in 60℃ it maintained half of its activity after 8h and after 24h it still has some of its activity. It suggest the good possibility for industrial use.
For the ion effects, except Co²⁺and Hg²⁺ other cations promote its protease activity. With detergents such as SDS or 5% of Tween 20 promote the protease activity and in case of TritonX-100, in 1% solution the activity was detected as best. This result suggest the this protease is suitable for detergent.
Reducing and oxydizing agents such as H₂O₂ and β-mercaptoethanol do not affect th activity much, which good for the industrial use.
Chapter 4. Development of cultivation technique of suitable native subtropical plant containing protease
Screened CAJ in first year was cultivated under the contract with local farmer near natral habitat and cheju National University experimental station for mass production.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 9
• 목차 ... 13
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 17
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 17
• 1. 기술적 측면 ... 17
• 2. 경제·산업적 측면 ... 18
• 3. 사회·문화적 측면 ... 18
• 제 2 절 연구개발 목표와 내용성 ... 18
• 1. 연구개발 목표 ... 18
• 2. 연구개발의 내용 ... 19
• 제 3 절 연구개발방법 ... 20
• 1. 프로테아제 다량 함유 아열대 식물의 탐색 ... 20
• 2. 탐색식물의 자생지 특성 및 생육특성 조사 ... 21
• 3. 프로테아제 함유량의 계절적?일주기적 변화 조사 ... 21
• 4. 프로테아제의 대량생산 시스템 개발 ... 21
• 5. 용도(세제용, 축산폐수 처리용) 개발을 위한 프로테아제의 특성 구명 ... 22
• 6. 농가재배기술 개발 ... 22
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 제 3 장 연구개발수행 방법 ... 24
• 제 1 절 프로테아제 다량함유 제주자생 아열대 식물의 탐색 및 생산기술 ... 24
• 1. 식물 CAJ의 프로테아제 활성 ... 24
• 가. 추출된 프로테아제의 온도에 대한 활성 ... 24
• 나. gelatin 분해활성 조사 ... 24
• 다. pH 안정성 ... 25
• 라. 시간에 따른 프로테아제 활성 ... 25
• 2. 프로테아제 활성에 미치는 중금속 이온의 영향 ... 25
• 3. 계면활성제의 영향 ... 25
• 제 2 절 탐색된 식물의 재배환경 조사 ... 25
• 1. 자생지 분포 특성 ... 25
• 2. 생육지 환경요인 조사 ... 25
• 3. 식물의 생육특성 분석 ... 25
• 4. 자생지 토양의 물리적 성질 조사 ... 26
• 5. 자생지 토양의 화학적 성질 조사 ... 26
• 6. 1차 선발된 식물의 기초재배시험 ... 26
• 제 3 절 천연프로테아제 대량 생산기술 개발 ... 27
• 1. 세제용 프로테아제의 대량생산 시스템 개발 ... 27
• 가. 조효소액 제조 ... 27
• 나. 황산암모늄 침전법 ... 27
• 2. 크로마토그래피법을 이용한 정제기술 ... 27
• 가. 세파크릴 S-100 겔 (Sephacryl S-100 gel) 여과 크로마토그래피 ... 27
• 나. DEAE-세파셀 칼럼 크로마토그래피 ... 28
• 다. 정제단계별 총단백질, 총활성도 산출 ... 28
• 3. DNA sequencing을 위한 정제 분리 ... 28
• 가. SDS-PAGE를 통한 단백질 분리 확인 및 분자량 결정 ... 28
• 나. 등전점전기영동(IEF) ... 29
• 다. Gelatin분해 활성 조사 ... 29
• 4. 프로테아제의 pH, 온도, 양이온 및 중금속, 계면활성제 및 산화환원제 존재시 활성요인 조사 ... 29
• 가. 프로테아제의 pH 안정성 및 최적 pH ... 29
• 나. 프로테아제의 열안전성 ... 29
• 다. 양이온 및 중금속 이온의 영향 ... 30
• 라. 계면활성제의 영향 ... 30
• 마. 산화환원제의 영향 ... 30
• 제 4 절 프로테아제 함유 아열대 식물의 재배기술 ... 30
• 1. 시험포장의 조성 ... 30
• 가. 재료 및 시험장소 ... 30
• 나. 비료 사용량에 따른 식물 CAJ 시험포장 처리 ... 30
• 2. 부산물비료 처리에 따른 토양화학성 및 토양물리성 변화 ... 31
• 가. 토양의 이화학적 분석방법 ... 31
• 나. 토양의 물리적 성질 분석방법 ... 32
• 3. 부산물비료 처리에 따른 식물 CAJ의 생육조사 ... 32
• 가. 지상부 생육 조사 ... 32
• 나. 지하부 생육 조사 ... 32
• 4. 농가 기술이전을 위한 다량 재배시 문제요인 조사 ... 33
• 가. 식물병해충 발생양상 및 방제기술 ... 33
• 나. 프로테아제 활성 유지기술 ... 33
• 제 4 장 연구개발수행 결과 ... 34
• 제 1 절 프로테아제 다량함유 제주자생 아열대 식물의 탐색 및 생산기술 ... 34
• 1. 식물 CAJ의 프로테아제 활성 ... 34
• 가. 추출된 프로테아제의 온도에 대한 활성 ... 34
• 나. gelatin 분해활성 조사 ... 35
• 다. pH 안정성 ... 36
• 라. 시간에 따른 프로테아제 활성 ... 37
• 2. 프로테아제 활성에 미치는 중금속 이온의 영향 ... 38
• 3. 계면활성제의 영향 ... 39
• 제 2 절 탐색된 식물의 재배환경 조사 ... 40
• 1. 자생지 분포 특성 ... 40
• 2. 생육지 환경요인 조사 ... 40
• 3. 식물의 생육특성 분석 ... 41
• 4. 자생지 토양의 물리화학적 성질 조사 ... 44
• 5. 1차 선발된 식물의 기초재배시험 ... 47
• 가. 종자 채취 및 보관 ... 47
• 나. 다량 번식용 재배시험 ... 47
• 제 3 절 천연프로테아제 대량 생산기술 개발 ... 49
• 1. 세제용 프로테아제의 대량생산 시스템 개발 ... 49
• 가. 조효소액 제조 ... 49
• 나. 황산암모늄 침전법 ... 49
• 2. 크로마토그래피법을 이용한 정제기술 ... 49
• 가. 세파크릴 S-100 겔 (Sephacryl S-100 gel) 여과 크로마토그래피 ... 49
• 나. DEAE-세파셀 칼럼 크로마토그래피 ... 50
• 다. 정제단계별 총단백질, 총활성도 산출 ... 51
• 3. DNA sequencing을 위한 정제 분리 ... 52
• 가. SDS-PAGE를 통한 단백질 분리 확인 및 분자량 결정 ... 52
• 나. 등전점전기영동(IEF) ... 54
• 다. Gelatin분해 활성 조사 ... 55
• 4. 프로테아제의 pH, 온도, 양이온 및 중금속, 계면활성제 및 산화환원제 존재시 활성요인 조사 ... 56
• 가. 프로테아제의 pH 안정성 및 최적 pH ... 56
• 나. 프로테아제의 열안전성 ... 56
• 다. 양이온 및 중금속 이온의 영향 ... 57
• 라. 계면활성제의 영향 ... 58
• 마. 산화환원제의 영향 ... 59
• 제 4 절 프로테아제 함유 아열대 식물의 재배기술 ... 60
• 1. 시험포장의 조성 ... 60
• 가. 비료 사용량에 따른 식물 CAJ 시험포장 처리 ... 60
• 2. 부산물비료 처리에 따른 토양화학성 및 토양물리성 변화 ... 61
• 가. 토양화학성분의 변화 ... 61
• 나. 토양의 물리성 변화 ... 67
• 3. 식물 CAJ 생육에 대한 부산물비료효과 ... 70
• 가. 지상부 생육비교 ... 71
• 나. 지하부 생육비교 ... 74
• 4. 농가 기술이전을 위한 다량 재배시 문제요인 조사 ... 75
• 가. 식물병해충 발생양상 및 방제기술 ... 75
• 나. 프로테아제 활성 유지기술 ... 75
• 제 5 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 77
• 제 6 장 연구개발결과의 활용계획 ... 77
• 제 7 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 78
• 제 8 장 참고문헌 ... 78
• 끝페이지 ... 79