초록 ▼

○ 연구결과
1. 벼 개화시기조절 유전자 FCA 및 CO cDNA 기능 및 특성규명
애기장대에서 FCA 유전자는 광주기에 영향을 안 받는 자발적 경로를 통해 개화시기를 조절한다. 본 연구팀은 애기장대 FCA유전자와 유사성을 갖는 homolog에 대한 cDNA와 유전자를 분리하였다. 이 유전자의 cDNA는 애기장대 FCA γ cDNA와 가장 유사성이 높고 830개의 아미노산을 구성한다. 벼의 FCA homolog는 두개의 RNA 결합부위와 한개의 WW 단백질 결합부위를 갖는데, 이 부위에서 애기장대 FCA 단백질과 70-8

○ 연구결과
1. 벼 개화시기조절 유전자 FCA 및 CO cDNA 기능 및 특성규명
애기장대에서 FCA 유전자는 광주기에 영향을 안 받는 자발적 경로를 통해 개화시기를 조절한다. 본 연구팀은 애기장대 FCA유전자와 유사성을 갖는 homolog에 대한 cDNA와 유전자를 분리하였다. 이 유전자의 cDNA는 애기장대 FCA γ cDNA와 가장 유사성이 높고 830개의 아미노산을 구성한다. 벼의 FCA homolog는 두개의 RNA 결합부위와 한개의 WW 단백질 결합부위를 갖는데, 이 부위에서 애기장대 FCA 단백질과 70-80%의 아미노산 상동성을 갖는다. 본 연구팀은 이 유전자를 OsFCA라 명명하였다. RT-PCR과 데이터베이스 검색을 통해서 인트론3의 차등적 접속과정과 폴리아데닐레이션이 벼에서도 진화적으로 보존되어있음을 알 수 있었다. 이 사실은 FCA의 인트론3가 FCA pre-mRNA의 차등적 접속과정 조절에 중요한 조절부위라는 것을 알 수 있었다.
Genomic Southern blot의 결과로 애기장대와 마찬가지로 벼에서도 FCA유전자가 한 copy라는 것을 알 수 있었다. OsFCA 유전자의 발현은 어린 조직(지상부위와 뿌리), 줄기, 꽃에서 많이 되었으며, 특히 어린 꽃조직에서 많이 관찰되었다. 그러나, 성숙한 줄기나 뿌리에서는 거의 발현양상이 보이질 않았다. 애기장대 fca-1 돌연변이체에 OsFCA 유전자를 35S promoter를 이용하여 과다발현시켰을 시 애기장대 fca-1 돌연변이체의 늦은 개화시기가 회복됨을 알 수 있었다.
벼에서 애기장대의 다른 개화시기 조절 유전자중에서 애기장대의 CO과 AGL20 homolog로 추정되는 것을 연구대상으로 삼았다. 벼의 CO 유사 유전자(NCBI 등재번호; AB001887)는 애기장대의 CO 유사 유전자들과 아미노산서열에서 높은 유사성을 나타내었다. 유전자 발현에서는 애기장대의 개화를 조절하는 경로 중 광주기 경로에 있는 GI, CO, FT와 같은 유전자들처럼 하루를 주기로 시간에 따른 주기적 발현양상을 보였다. 또한, 공간적 발현양상 조사에서 영양생장기에는 약하게 발현되고 panicle의 발달시기에 강하게 발현되는 것으로 관찰되었다. 애기장대 AGL20과 70%의 아미노산 유사성을 보이는 FDRMADS8(NCBI 등재번호; AF141965)의 경우는 꽃기관 결정에 관여하는 다른 MADS box 유전자들과 유사성을 비교했을 시에는 상대적으로 낮았다. 그리고, AGL20과 유전체 구조를 비교했을 시에는 인트론의 삽입부위, 상대적 크기, 수가 유사한 경향을 보였다. 또한, 계통분석에서 다른 MADS box 단백질보다 애기장대 AGL20 유전자에 더욱 근접함을 알 수 있었다. 벼에서 조직별 발현양상을 분석했을 시 애기장대 AGL20의 발현양상과 유사한 양상을 보였다. 이 중에서 FDRMADS8을 벼에 과다발현시킨 형질전환체를 만들었으며, 또한 애기장대 FT를 벼에 과다발현시킨 형질전환체를 만들어 분석중에 있다.
2. 벼 FCA의 유전자 분리 및 FCA 형질전환체 생산
OsFCA 유전자의 genomic clone을 얻기 위해 미국의 Clemson University에서 구입한 BAC library를 OsFCA cDNA를 탐침으로 screening하였다. 이를 통해 16개의 BAC clone을 선발하여 다시 HindIII를 처리한 후 Southern blot을 수행하여 09G08 BAC clone으로부터 약 11.5kb의 HindIII 단편이 OsFCA전체 유전자를 포함한다는 것을 알아내었다. OsFCA 유전자는 17개의 엑손과 16개의 인트론을 포함하고 있었으며, 유전자의 구조는 애기장대 FCA와 전체적으로 유사하였다. 애기장대와 벼의 FCA 유전자의 구조는 인트론의 수, 크기, 삽입위치에서 거의 유사하였다. 애기장대 FCA의 인트론3 크기는 2076bp로 가장 길었고, 다른 인트론의 크기는 81-361bp 정도였다. 유사하게 벼 FCA의 인트론 3 크기는 2503bp로 가장 길었고, 다른 인트론의 크기는 69-661bp 정도였다. 지금까지 벼에서 밝혀진 출수기에 관련된 QTL은 14개이며, OsFCA 유전자의 벼 염색체상의 위치는 염색체 9번 상단에 존재하였다. 아직까지 그 위치에서는 출수기에 관련된 QTL이 확인된 바가 없다.
애기장대 FCA 유전자는 과다발현시 개화시기를 앞당기기 때문에 벼에서 출수기를 조절하기 위해 OsFCA 유전자의 유용성을 확인해보았다. Cauliflower 모자익 바이러스의 35S 프로모터를 이용하여 OsFCA cDNA를 과다발현시킬 pB2PFT 형질전환벡터를 agrobacterium을 이용하여 벼에 형질전환시켰다. Basta 저항성을 가진 형질전환체로부터 genomic DNA를 추출하여 PCR과 genomic Southern blot을 통해 형질전환 유전자의 존재를 확인하였다.
46개의 형질전환체가 형질전환 유전자를 가지고 있음을 확인하였다. 온실과 GMO 포장에서 키운 형질전환체의 출수기가 다른 벼품종인 운두벼, 소백벼, 낙동벼, 그리고 일품벼의 출수기와 비교를 하였다. 대부분의 형질전환벼의 출수기가 극조생 벼품종의 출수기에 비해 1주나 1주정도 늦음이 확인되었다.
또한, 극조생 벼품종의 개발을 위해 다른 개화시기 조절 유전자의 Os CO -like와 Hd-1 유전자를 가진 형질전환체를 만들어 분석중에 있다.

Abstract ▼

1. The analysis of function and churacterization of the rice flowering time gene, OsFCA and OsCO-like
In Arabidopsis, FCA regulates flowering time via a pathway that is independent of daylength. We isolated a cDNA clone and its genomic clone from rice, which showed significant homology to FCA. Th

1. The analysis of function and churacterization of the rice flowering time gene, OsFCA and OsCO-like
In Arabidopsis, FCA regulates flowering time via a pathway that is independent of daylength. We isolated a cDNA clone and its genomic clone from rice, which showed significant homology to FCA. The cDNA clone contains an open reading frame of 830 amino acids, having homology with the predicted protein of the FCA γ transcript. The two RNA binding domains and a WW protein interaction domain of the rice cDNA-encoded protein have about 70- 80 % amino acid identity with those of the FCA γ protein. Therefore, we designated this gene as OsFCA. RT-PCR and in silico search also revealed that the alternative splicing and polyadenylation of intron 3 wereconserved in rice. It is speculated that the intron 3 of the FCA might be a major control point for alternative splicing of the FCA pre-mRNA. Genomic Southern data indicated that the OsFCA was presumbably a single copy gene in rice genome like FCA in Arabidopsis genome. The OsFCA transcripts were detectable in young tissues (aerial tissue and roots), stems,and flowers, except that flowers of younger stages showed higher transcript level, but not in matured leaves and roots. Ectopic overexpression of the OsFCA using 35S promoter in Arabidopsis fca-1 could partially rescue the late-flowering phenotype of the fca-1. These data suggest that the OsFCA may be a functional homolog of the FCA.
From rice (Oryza sativa L.) DNA sequence databases, two cDNA clones [AB001887 and AF141965] with significant similarity to the Arabidopsis flowering time genes was found. The cDNA clone [AB001887] shows significant amino acid sequence homology (53%) with Arabidopsis COL2. The expression of the photoperiod pathway genes such as GI, CO, COL1 and COL2 are under circadian control in Arabidopsis. Recently, the expression of the rice homologues of Arabidopsis GI, CO, and FT was shown to be under circadian control. The expression pattern of the rice homologue of CO family is investigated. The expression pattern of OsCO-like gene [AB001887], rice homologue of Arabidopsis COL, was under circadian control. And OsCO-like gene transcript is more abundant at the late panicle development stages than earlier stages and vegetative stages. In the case of FDRMADS8 [AF141965] which is significant similarity with Arabidopsis AGL20, there was higher amino acid similarity score, compared with other rice MADS box genes involved in floral organ identity. The structure of this genes was similar to AGL20 in terms of the insertion site, relative size, and number of the introns. Phylogenic analysis also revealed that the amino acid sequence of FDRMADS8 was closer to Arabidopsis AGL20 than other MADS box proteins. To investigate gene expression of this gene, we performed northern blot analysis in rice. This gene is expressed in panicle and seedling developmental stages. These ubiquitous expression patterns are similar to those of Arabidopsis AGL20 gene.
Also, the transgenic rice plants overexpressing rice FDRMADS8 and Arabidopsis FT were made and their characteristics are being examined.
2. The isolation of the OsFCA gene and the production of OsFCA transgenic rice plants
In order to obtain the genomic clone of the OsFCA, the rice BAC library (CUGI) filter was screened with it's eDNA clone. From this experiment, sixteen positive BAC clones were obtained. Southern blot was also perfonned to obtain the genuine BAC clone containing OsFCA gene.
An 11.5kb HindⅢ fragment oblaind from BAC clone 09G08 turned out to contain lhe full-length gene for the OsFCA eDNA clone. The OsFCA gene consists of 17 exons and 16 introns. The stnlclure of this gene is similar to that of FCA in general. That is, the OsFCA and the FCA are similar in general to each other in terms of the insertion site, relative size, and number of introns. The intron 3 of the FCAis 2076 bp long while the size of other introns is between 81 bp and 361 bp. Similarly, the intron 3 of the OsFCA is 2503 bp long, but the size of other introns is between 69 bp and 661 bp. So far. fourteen OTLs for heading date were identified through molecular marker-based mappmg in rice. The chromoso-mal position of OsPCA is examined using recombinant inbred lines. There is no known QTL for heading date on upper position of chromosome 9, but the OsFCA was mapped on it.
Since the flowering time gene FCA can accerelate flowering in Arabidopsis, the usefulness of OsFCA for manipulating heading date in rice has been tested. Plasmid pB2PFT, which contains a OsFCA eDNA driven by the cauliflower mosaic virus 3GS promoter, was transformed vIa Agrobacterium-mediated method. Rice genomic DNA was extracted from basta resistant lines (T2), and the presence of the transgene was determined by polymerase chain reaction (PCR) using transgene specific primer, which amplify a 499 bp fragment of OsFCA eDNA. Also, genomic Southern blot was performed. Forty six independent T2 lines were shown by PCR and genomic Southern blot to contain the OsFCA cDNA transgene. The heading date of the putative 35S::OsFCA transgenic rice plants was determined. Many independent transgenic lines were grown in greenhouse and GMO paddy field and the heading date of them was compared with some rice cultivars (Undo-byo, Sobak-byo, Nakdong-byo, and Hpoom-byo). The heading date of many transgenic lines grew slowly than this of early rice cultivars, with one or two weeks.
Also, in order to test the possibility of early heading rice cultivars. the transgenic line o[ other flowering time genes (Os CO-like and Hd-1) were made.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 11
• 목차 ... 13
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 14
• 제1절 연구개발의 목적 ... 14
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 14
• 1. 기술적 측면 ... 14
• 2. 경제.산업적 측면 ... 15
• 3. 사회.문화적 측면 ... 15
• 제3절 연구개발의 범위 ... 16
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 17
• 제1절 국내외 관련분야에 대한 기술개발현황과 문제점 ... 17
• 1. 극조생 벼 육종현황과 문제점 ... 17
• 2. 자발적인 개화유도 경로(autonomous Promotion Pathway)와 FCA ... 18
• 3. 벼의 개화시기조절 유전자에 대한 연구현황 ... 19
• 제2절 연구결과가 국내외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 21
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 22
• 제1절 이론적, 실험적 접근방법 ... 22
• 1. 벼 개화시기조절 유전자 FCA의 기능 및 특성 규명 ... 22
• 2. 벼 FCA의 유전자 분리 및 FCA의 형질전환체 생산 ... 29
• 제2절 연구내용 ... 36
• 1. 벼 개화시기조절 유전자 FCA의 기능 및 특성 규명 ... 36
• 2. 벼 FCA의 유전자 분리 및 FCA의 형질전환체 생산 ... 38
• 제3절 연구결과 ... 39
• 1. 벼 개화시기조절 유전자 FCA의 기능 및 특성 규명 (주관과제) ... 39
• 2. 벼 FCA의 유전자 분리 및 FCA와 COL의 형질전환체 생산 (협동과제) ... 79
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 119
• 제1절 연차별 연구목표 및 평가착안점에 입각한 연구개발목표의 달성도 ... 119
• 제2절 관련분야의 기술발전에에의 기여도 ... 121
• 1. 기술적 측면 ... 121
• 2. 경제.산업적 측면 ... 121
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 123
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 124
• 제7장 참고문헌 ... 125
• 끝페이지 ... 132