초록

○ 연구결과
최적배양조건 및 제제의 처방을 확립
protoplast 형성에 적합한 효소, 농도, 배양시간 구명 및 regeneration 조건 확립 병원성관련유전자(Pr1 Gene) 도입으로 Pr1 gene을 multi-copy로 갖는 균주를 개발 미생물농약의 합리적인 방제효과 검정방법 및 표본추출법 등을 개발ㆍ제시

Abstract ▼

Biological control using the entomopathogenic fungi is the environmental-friendly pest control method and microbial control products have been developed already in advanced countries. In this study, the Verticillium lecanii CS-626 strain, selected for the biological control of greenhouse whitefly, w

Biological control using the entomopathogenic fungi is the environmental-friendly pest control method and microbial control products have been developed already in advanced countries. In this study, the Verticillium lecanii CS-626 strain, selected for the biological control of greenhouse whitefly, was developed and tested as a microbial pest control product. The CS-626 strain was mass-cultured, formulated, and the effective use of the strain was tested in the tomato field. Also a genetically transformed strain, resistant to benomyl fungicide, was developed as an effective pest control agent for the integrated pest management.
1. Mass production and formulation of the CS-626 strain
For mass production of the CS-626 strain, various nutrients and fermenting conditions were stuied.
As a results, the optimal condition were as follows : high fructose 4.68%, soybean sauce cake 1.63%, culture temperature 20℃, and pH 5.5.
And for formulation of the CS-626 strain, several surfactants and carriedrs were studied.
As a results, the hysical properties of testing product were desirable for spraying.
2. Development of benomyl resistant transformant of the CS-626 strain
This xperiments were designed to improve benomyl resistance and pathogenicity in V. lecanii by gene transformation system.
A standard procedure of protoplasts isolation was established using commercial lytic enzyme. Maximum protoplast yield was obtained when 0.1~0.2g of 20 hrs-grown mycelia was incubated in a mixture of lytic enzyme, 10 mg dreselase/ml and an osmotic stabilizer, 0.6 M KCI at 30℃ for 3 hrs.
The plasmid pBRG-4 contains a 3.4 kb β-tubulin gene originated from Aspergillus flqvus which is resistant to benomyl. Approximately 1㎍ of modified pBRG-4 was introduced into the protoplasts by treatment with PEG(Polyethylene Glycol). Transformation experiments were coarried out three times and 85 transformants were obtained.
Integration of the transforming DNA into the genomic DNA was confirmed by PCR amplification and Southern hybridization. The primers used in PCR amplification were designed on the basis of specific nucleotide sequence of the altered β-tubulin. PCR fragment, specifically amplified from genomic DNA of the each of seven transsormants, was not amplified from that of wild type. For Southern blotting, a PCR fragment amplified from the plasmid was used as a probe. Hybridization signal appeared on blots of transformants but not on that of wild type. These results indicated that A. flavus β-tubulin was successfully integrated into the V. lecanii CS-626 genome, and consequently the CS-626 should be transformed into the benomyl-resistant strain.
Finally, characters of thses transformants, including germination rate and growth rate, were compared with those of wild type. All trasformants showed up to 90% germination rate. The T14 and T65 exhibited the highest growth rate on PDA medium containing 50㎍ benomyl/ml. The T41 revealed the highest growth rate on PDA medium lacking benomyl.
3. Test of control efficacy and use of the CS-626 strain
For the test of control efficacy by the CS-626 strain, we carried out total five greenhouse field trials using the MPCA(Microbial Pest Control Agent) or the MPCP(Microbial Pest Control Product) of the strain in Suwon and Buyeo. As a result, mortality of whitefly scales was high(70~92%) in both of the MPCA and the MPCP. Also, phytotoxicity was not shown in the final MPCP. When the application of the strain was repeated one week after application, the control efficacy was durable in 3 weeks.
Densities of whitefly adults in plot and tomato plant, and of scales in a leaflet of tomato were examined as biological factors related to the mortality by the strain. Temperature and relative humidity were also investigated and analyzed in the greenhouse as abiotic factor. Different density of whitefly in higher and lower leaf shelves in a tomato plant caused the different control efficacy in each leaf shelves. Spatial distribution of whitefly scales in a leaflet was changed from regular pattern to contagious pattern in relation to the increase of density of scales. Increasing of the density of scales in a leaflet caused the decreasing of the distance to the nearest scale, and the decreased distance between the scales might be a factor of infection by the second conidia during the log phase of the mortality test. Temperature and relative humidity were fluctuated severely in the greenhouse fields. However, the environmental factors were not restrictive to the high mortality by the MPCP.
In consequence of the field trials and bio-assays, we proposed the effective application method in the spring cropping season of Buyeo, the chief producing district of tomato in Korea.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 9
• 목차 ... 13
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 17
• 1절 서론 ... 17
• 1. 온실가루이의 특성 및 피해 상황 ... 17
• 2. Verticillium lecanii의 생물적 특성 ... 18
• 2절 연구개발의 목적 ... 20
• 3절 필요성 ... 20
• 4절 연구 범위 ... 22
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 1절 국외 기술개발 현황 ... 23
• 2절 국내 기술개발 현황 ... 24
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 26
• 1절 연구 방법 ... 26
• 1. CS-636균주의 대량생산 및 제제화 연구 ... 26
• 2. CS-626균주의 병원성 형질전환 균주 개발 ... 27
• 가. Verticillium lecanii적합한 Protoplast 제조기술 확립 ... 27
• 1) 균사체 배양 ... 28
• 2) 효소 선정 ... 28
• 3) Driselase 적정농도 구명 ... 28
• 4) 삼투압 안정제 선정 ... 28
• 5) 효소 반응 처리 시간 구명 ... 29
• 6) 베노밀 농도에 따른 protoplast 재생(regeneration) ... 29
• 나. 병원성유전자 도입을 통한 형질전환 ... 29
• 1) Verticillium lecanii의 genomic library 제작 및 promotor 분리 ... 29
• 2) Promoter 염기서열 조사 ... 30
• 3) Shuttle vector 제작 ... 30
• 4) CS-626균주의 형질전환 ... 30
• 다. 형질전환 균주의 특성조사 ... 31
• 1) 발아율 ... 31
• 2) 성장속도 ... 31
• 3. CS-626 균주를 이용한 곰팡이 살충제의 효능검증 및 이용 방법 연구 ... 31
• 가. CS-626 원제의 살충력 포장 검정 ... 32
• 나. CS-626 제제(수화제)의 분무처리 특성 및 살충력 포장 검정 ... 33
• 다. CS-626 균주의 살충력에 영향을 미치는 생물적 요인 ... 33
• 1) 포장 및 토마토 주내에서 온실가루이 성충의 분포 양상 ... 33
• 2) 토마토 소엽내에서 온실가루이 약충 밀도 및 공간분포 양상 ... 34
• 라. CS-626 균주의 살충력에 영향을 미치는 환경적 요인 ... 36
• 마. CS-626 제제의 효율적 이용 방법 제안 ... 36
• 2절 연구 내용 및 결과 ... 36
• 1. CS-626균주의 대량생산 및 제제화 연구 ... 36
• 2. CS-626균주의 병원성 형질전환 균주 개발 ... 51
• 가. Protoplast 제조기술 확립 ... 51
• 1) 효소 선정 ... 51
• 2) Driselase 적정농도 구명 ... 51
• 3) 삼투압 안정제 선정 ... 52
• 4) 효소 반응 처리 시간 구명 ... 53
• 5) 베노밀 농도에 따른 protoplast 재생 ... 54
• 나. 병원성유전자 도입을 통한 형질전환 ... 56
• 1) Verticillium lecanii의 genomic library 제작 및 promoter 분리 ... 56
• 2) Promotor 염기서열 조사 ... 57
• 3) Shuttle vector 제작 ... 58
• 4) CS-626균주의 형질전환 ... 59
• 다. 형질전환 균주의 특성조사 ... 61
• 1) 발아율 ... 61
• 2) 성장속도 ... 62
• 3. CS-626 균주를 이용한 곰팡이 살충제의 효능검증 및 이용 방법 연구 ... 63
• 가. CS-626 원제의 살충력 포장검정 ... 65
• 나. CS-626 제제(수화제)의 분무처리 특성 및 살충력 포장 검정 ... 67
• 다. CS-626 균주의 살충력에 영향을 미치는 생물적 요인 ... 71
• 1) 포장 및 토마토 주내에서 온실가루이 성충의 분포 양상 ... 71
• 2) 토마토 소엽내에서 온실가루이 약충 밀도 및 공간분포 양상 ... 78
• 라. CS-626 균주의 살충력에 영향을 미치는 환경적 요인 ... 88
• 마. CS-626 제제의 효율적 이용 방법 제안 ... 92
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 95
• 1절 연구개발 목표의 달성도 ... 95
• 1. CS-626균주의 대량생산 및 제제화 연구 ... 95
• 2. CS-626균주의 병원성 형질전환 균주 개발 ... 95
• 3. CS-626 균주를 이용한 곰팡이 살충제의 효능검증 및 이용 방법 연구 ... 95
• 2절 관련분야 기술발전에의 기여도 ... 95
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 97
• 1. CS-626균주의 대량생산 및 제제화 연구 ... 97
• 2. CS-626균주의 병원성 형질전환 균주 개발 ... 97
• 3. CS-626 균주를 이용한 곰팡이 살충제의 효능검증 및 이용 방법 연구 ... 97
• 가. 학술지 논문 게재 ... 97
• 나. 국제 심포지움 발표 ... 98
• 다. 국내 학술회의 발표 ... 98
• 라. 신문 및 잡지 기사 게재 ... 98
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 100
• 제 7 장 참고문헌 ... 101
• 끝페이지 ... 107