초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
돼지 유행성 설사병 바이러스와 돼지 전염성 위장염 바이러스를 감별진단 할 수 있는 다중 역전사 중합효소 반응을 개발하였다. 돼지 유행성 설사병 바이러스와 돼지 전염성 위장염 바이러스의 membrane(M) gene과 nucleotide(N) gene에서 각각 412 basepair, 612 base pair크기로 증폭되었으며 상호간의 교차반응은 관찰되지 않았다. 그 민감도 또한 10 TCID50로서 매우 적은 양의 바이러스도 검출할 수 있었으며, RNase inhibitor들이 다량 포

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
돼지 유행성 설사병 바이러스와 돼지 전염성 위장염 바이러스를 감별진단 할 수 있는 다중 역전사 중합효소 반응을 개발하였다. 돼지 유행성 설사병 바이러스와 돼지 전염성 위장염 바이러스의 membrane(M) gene과 nucleotide(N) gene에서 각각 412 basepair, 612 base pair크기로 증폭되었으며 상호간의 교차반응은 관찰되지 않았다. 그 민감도 또한 10 TCID50로서 매우 적은 양의 바이러스도 검출할 수 있었으며, RNase inhibitor들이 다량 포함되어 있는 분변 또는 장조직 샘플에서도 두 바이러스를 교차반응 없이 검출할 수 있었다. 바이러스성 설사가 의심되어 의뢰된 포유자돈 및 분변샘플 1258건 중에서 총 634건이 돼지 유행성 설사병 바이러스로 진단되었으며, 11건이 돼지 전염성 위장염 바이러스로 진단되었다. 그 질병 발생 분포는 일년 년중 발병하고 있었으며, 주로 11월 중순에서 3월 사이에 폭발적으로 발생하는 것으로 조사되었다.
이 연구를 통하여 밝혀진 돼지 바이러스성 설사병은 년중 발생하는 epizootic type과 계절적 발병 양상을 보이는 epidemic type이 있는 것으로 조사되었고, 포유자돈의 바이러스성 설사에서 그 빈도가 높은 것을 확인할 수 있었으며, 돼지 전염성 위장염 바이러스는 빈도가 매우 낮아 계절 백신에 대한 대책을 제고할 가치가 있다 하겠다. 또한, 돼지 유행성 설사병 바이러스와 돼지 전염성 위장염 바이러스에 대한 조직내 교잡법을 개발하여 진단법으로 확립하였다. 두 바이러스는 공장과 회장부위의 장상피 표면에서 관찰되었으며, 전염성 위장염 바이러스의 경우 드물게 음와 부위에서 관찰되었다. 조직내 교잡법 결과를 바이러스 분리, 형광항체법, 전자현미경을 이용한 검사법과비교한 결과 그 민감도와 특이도가 높아 진단법으로 매우 유용할 것으로 평가되었다.
7-21일령 사이에 다발하는 돼지 콕시듐 설사병을 진단하기 위한 병리조직 검사법을 확립하였다. 이는 여름철 다발하는 콕시듐 설사병 진단에 매우 유용하게 사용되었다. 육성․비육기 소화기 질환에서 큰 비중을 차지하는 증식성 회장염과 살모렐라증을 병리조직학적 검사, 중합효소 연쇄반응, 조직내 교잡법, 면역조직화학법을 이용한 진단법을 확립하였다.
만성적인 호흡기 질환을 유발하는 위축성 비염, 파스튜렐라성 폐렴과 마이코플라즈마성 폐렴 진단을 위하여 다중 중합효소 연쇄반응을 개발하여 비강면봉을 이용하여 신속한 진단을 할 수 있게 되었다. 조직내 교잡법을 이용하여 포르말린 고정되고 파라핀포매된 조직에서도 마이코플라즈마성 폐렴과 파스튜렐라성 폐렴에 대한 진단법을 확립하였다. 본 연구에서 개발된 호흡기 질환의 진단법은 매우 신속 정확하며 부검을 실시하지 않고서 비강면봉만으로도 진단할 수 있는 검사법으로 그 유용성이 크다고 하겠다. 돼지 호흡기 질환에 있어 상당한 비중을 차지하고 있는 돼지 파스튜렐라 균(Pasteurella multocida)을 임상 가검물로부터 분리하였으며, 230개의 분리주에 대하여 혐막 혈청형과 toxA 유전자의 보유여부를 조사하였다. 230개의 균주 중에서 30개의 균주가 toxA유전자를 가지고 있었으며, 87%의 균주가 협막 혈청형 A군에, 4%는 D군에속하는 것으로 조사되었다. 호흡기 질환에 사용되는 11종의 대표적인 항생제에 대하여항생제 감수성 검사를 수행하였으며, ceftiofur, danofloxacin, gentamicin 및 penicillin에 대하여 효과가 있는 것으로 나타났다. 항생제 감수성 결과는 질병 진단과 병행하여 질병 대책 수립에 있어서도 유용하게 사용될 것이다.
돼지 소모성 질환인 이유자돈 전신성 소모성 증후군과 양돈 산업에 있어 막대한 영향력을 미치고 있는 돼지 콜레라를 대표적으로 들수 있다. 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 원인체인 돼지 써코바이러스 2형과 이와 상관성이 있는 것으로 알려진 돼지 파보바이러스 및 돼지 콜레라 바이러스에 대한 중합효소 연쇄반응법, 조직내 교잡법, 면역 조직 화학법이 개발되었다. 또한, 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 경우 단독 감염보다 혼합감염의 예가 많아 복합감염 예를 조사하였으며, 그 주된 병원체로서는 Haemophilus parasuis, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Swine influenza virus의 순으로 빈도가 높게 조사되었다. 이는 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 진단 및 치료에 있어 혼합 감염의 차단이 매우 중요할 것으로 사료된다. 또한, 이유자돈 전신성 소모성 증후군의 원인체로 부각되고 있는 돼지 써코바이러스 2형과 상관성이 높은 것으로 알려지고 있는 새로운증후군인 돼지 피부염 신부전 증후군(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome: PDNS), 유산(Abortion), 삼출성 표피염(Exudative Dermatitis), 증식성 괴사성 폐렴(Proliferative and Necrotizing Pneumonia: PNP)에 대한 상관성 연구가 추가적으로 수행된다면, 이유자돈 전신성 소모성 증후군에 대한 방역 수립에 대한 근거를 제공 할 것이다. 본 연구에서 개발된 돼지 콜레라 진단법은 그 민감도가 높고, 검사의 신속성과 정확성을 기할 수 있게 되었다. 국내에서 돼지 콜레라에 대한 박멸 사업이후 돼지 콜레라의 발생 예가 급속히 감소하여 청청화 선언을 하기에 이르렀으나, 박멸사업에 성공한 선진국들의 예에 비추어 보았을 때 정확한 진단법을 바탕으로 한 질병 발생의 감시가 중요하다. 따라서, 종돈장을 비롯하여 무역시 거래되는 축산물에 대한 검역,국내 질병의 감시에 본 진단법을 적용하는 것이 바람직하며, 이는 본 연구에서 수행된 임상가검물에 대한 진단 시스템 운영을 통해 검증되었다.

Abstract ▼

In this project, diagnostic system of porcine diseases was developed and optimized for Korean swine industry. This project is consists of three main parts: diagnosis of porcine enteric diseases, diagnosis of porcine respiratory diseases, diagnosis of porcine wasting diseases.
A multiplex reverse

In this project, diagnostic system of porcine diseases was developed and optimized for Korean swine industry. This project is consists of three main parts: diagnosis of porcine enteric diseases, diagnosis of porcine respiratory diseases, diagnosis of porcine wasting diseases.
A multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was developed for the simultaneous detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and transmissible gastroenteritis virus (TGEV) in preweaning pigs with diarrhea. PCR products of PEDV and TGEV were 412 and 612 base pair, respectively. Diagnostic technique for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) was developed by In situ hybridization with a non-radioactive digoxigenin-labeled probe. A 377 base pair cDNA probe for viral RNA encoding the membrane proteins of PEDV V215/78 was generated by the reverse transcription polymerase chain reaction. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissues naturally infected with transmissible gastroenteritis virus (TGEV) were examined by in situ hybridization for TGEV nucleic acid using a nonradioactive digoxigenin-labeled cDNA probe. In situ hybridization technique for TGEV were compared with virus isolation (VI), a fluorescent antibody test (FAT), and transmission electron microscopy (TEM). Among 21 ISH positive samples, 5 (24%) were positive for TGEV by all 4 tests, 15 (71%) were positive by FAT, 14 (67%) were positive by VI, and 6 (29%) were positive by TEM. In situ hybridization for detection of TGEV in formalin-fixed paraffin-embedded tissues provides a rapid means of confirmation of a histopathological diagnosis of TGEV without virus isolation. Detection method of Lawsonia intracellularis was studied in formalin-fixed paraffin-embedded intestinal tissues from naturally infected pigs by immunohistochemistry with a monoclonal antibody against outer membrane protein of L. intracellularis. Warthin-Starry silver stain revealed clusters of argyrophilic, slightly curved rod-shaped organisms in the apical cytoplasm of enterocytes. The presence of L. intracellularis in the ileum of pig with proliferative enteropathy was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) further on the basis of amplification of 319 base pair products specific for porcine L. intracellularis chromosomal DNA. Immunohistochemistry and PCR may be a complementary method to confirm the diagnosis of L. intracellularis infection in pigs. A total of 720 Escherichia coli strains isolated from diarrheic piglets on 756 swine farms were screened for the presence of the enteroaggregative E. coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1) gene by polymerase chain reaction (PCR).
Escherichia coli strains that carried EAST1 genes were also tested by PCR for the presence of 4 fimbriae (F4, F5, F6, F41), 2 heat-stable enterotoxins (STa and STb), and 1 heat-labile enterotoxin (LT) gene. One hundred sixty-four (22.7%) of the 720 E. coli isolates carried genes for EAST1. Of these 164 isolates, 62 (37.8%) carried EAST1 genes only, 11 (6.7%) carried genes for at least 1 of the fimbrial adhesins, 51 (31.1%) carried genes for at least 1 of the enterotoxins, and 40 (23.8%) carried genes for at least 1 of the fimbrial adhesins and enterotoxins. Forty-six percent of strains that carried EAST1 genes carried STa genes, and 16% of strains that carried EAST1 genes carried F4. The isolation rate of enterotoxigenic E. coli strains carrying genes for EAST1 gene was 63%. The 6 major genotypes were EAST1+, EAST1+STa+, EAST1+STa+STb+, EAST1+STa+F5+, EAST1+STa+F4+, and EAST1+STb+F4+. EAST1 is widely prevalent among diarrheagenic strains of E. coli and may represent an important virulence determinant in the pathogenesis of enteric colibacillosis of preweaned pigs Pasteurella multocida and Mycoplasma hyopneumoniae are major bacterial pathogens in porcine respiratory diseases. Although rapid diagnosis in respiratory diseases is the key to control disease, culture and isolation of respiratory pathogens are difficult and time-consuming. So, rapid and efficient diagnostic tool are necessary. The nested polymerase chain reaction for toxigenic Pasteurella multocida was developed. This was a sensitive and reproducible technique and it represented a promising method to be used as a diagnostic tool for confirming the presence of toxigenic P. multocida directly from nasal swab without culture. The prevalence and relationship of capsular serotypes and toxA gene in P. multocida isolates were examined. The most prevalent capsular serotype was capsular serotype A and the majority (87%; 174 out of 200) of P. multocida isolates from pneumonic lungs were nontoxigenic.
Moreover, multiplex nested polymerase chain reaction was optimized for the detection and differentiation of toxigenic Pasteurella multocida and Mycoplasma hyopneumoniae. Mycoplasma hyopneumoniae DNA was detected in 20 naturally infected pigs by in situ hybridization using a nonradioactive digoxigenin-labeled DNA probe. A 520-base-pair DNA probe targeting a reiterative sequence of the M. hyopneumoniae genome was generated by the polymerase chain reaction. The in situ hybridization technique developed in this study was useful for detection of M. hyopneumoniae nucleic acids in tissues taken from naturally infected piglets and may be a valuable technique for studying the pathogenesis of M. hyopneumoniae infection.
Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) associated with Porcine Circovirus 2 is an emerging disease in pig that characterized by emaciation, dyspnea, and lymph node enlargement. Natural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), recorded from January 1999 to December 2000, were determine the prevalence, microscopic lesions, and other coexisting pathogens associated with PMWS. One hundred and thirty three (8.1%) of the 1634 pigs submitted from 1243 pig farms were diagnosed for PMWS. The majority of cases (113 cases, 85.0%) was dual infection with other pathogens. The combination of PCV2 and Hemophilus parasuis (43 cases, 32.3%) was shown to be the most prevalent followed by PCV2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (39 cases, 29.3%). Optimized DNA extraction method and nested PCR were developed for the detection of PCV2 from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Conventional PCR, nested PCR, and in situ hybridization methods were also compared for the detection of PCV2 in archival tissues. A method based on xylene deparaffinization followed by proteinase K digestion yielded DNA of sufficient quality for PCR analyses reliably and consistently. A distinct positive signal for PCV2 was detected in spleen and lymph node from all 37 pigs through in situ hybridization. The nested PCR and in situ hybridization could be applied successfully to archival tissues for the detection of PCV2 DNA. Non-radioactive digoxigenin-labelled probes that can differentiate PCV1 from PCV2 in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by in situ hybridization were developed. A 349 base pair DNA fragment from open reading frame 1 of PCV1 and a 481 bp DNA fragment from ORF 2 of PCV2 generated by PCR were used as PCV1 and PCV2 probes, respectively. Double in situ hybridization to simultaneously detect PCV1 and PCV2 or PCV2 and PPV in the same tissue section was developed. The combination of an alkaline phosphatase conjugated antidigoxigenin system with alkaline phosphatase or peroxidase conjugated streptavidin-biotin system allowed identification of PCV1 and PCV2 or PCV2 and PPV. This double labeling technique is suitable both for pathogenesis studies and for diagnostic applications. A seminested reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was developed for the detection of classical swine fever virus (CSFV) in semen. CSFV from boar semen was infrequently identified by virus isolation compared with seminested RT-PCR. CSFV nucleic acid was detected in semen by seminested RT-PCR as early as 7 dpi in three infected boars and persistently thereafter in all five infected boars until 63 dpi. When separated fractions of CSFV-contaminated semen were analyzed by the seminested RT-PCR, the CSFV nucleic acid was detected mainly in seminal fluid and occasionally in nonsperm cells. CSFV antigen was also detected in nonsperm cells from semen smear by immunohistochemistry. Thus, infection via semen, specially through CSFV-infected seminal fluid, seems to be a major route of transmission of CSFV. CSFV could be detected by in situ hybridization technique from reproductive organ tissues of boars and sows. The distribution of classical swine fever virus (CSFV) was determined in the testicular tissue of infected boars. Viral nucleic acid was localized to spermatogonia, spermatocytes and spermatids but not in the epithelia of the prostate, epididymis, or bulbourethral gland in boar. The demonstration that CSFV infects the spermatogonia and their progeny suggests that this may serve as a primary reservoir for the venereal spread of CSFV. The CSFV in their ovarian tissues was located almost exclusively with the cytoplasm of cells shown by HE-staining to be macrophages, which were numerous in atretic follicles. Small numbers of CSFV-nucleic acid-positive cells with distinctly round morphology and oval nuclei, resembling monocytes were also observed in the blood vessels in sows. The experiment suggested that CSFV replicate in circulating peripheral monocytes, at least to a limited extent, having gained access to ovarian tissues from bloodstream and that these contribute to the localization of CSFV in macrophages throughout the atretic follicle. CSFV nucleic acid and antigen were detected in pigs with chronic CSF by in situ hybridization and immunohistochemistry. The most consistent and prominent microscopic lesions are perivascular mononuclear cell infiltration gliosis in the central nervous system from pigs with chronic CSF. A positive signal for both in situ hybridization and immunohistochemistry was detected in mononuclear cells and lymphocytes of lymphoid tissues. However, viral nucleic acid was detected in some tissue sections in absence of viral antigen. The in situ hybridization technique developed in this study was useful for the detection of CSFV RNA in tissues taken from chronically infected pigs.

목차 Contents

• 최종보고서 ... 1
• 표지 ... 2
• 제출문 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 15
• 목차 ... 19
• 제1장 서 론 ... 22
• 제1절 연구개발의 목적과 범위 ... 22
• 제2장 돼지 소화기 질환 진단법 개발 ... 25
• 제1절 서 설 ... 25
• 제2절 재료 및 방법 ... 26
• 1. 다중 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 유행성 설사병과 돼지 전염성 위장염의 감별 진단법 개발 ... 26
• 2. 조직내 교잡법을 이용한 돼지 유행성 설사병 진단법 개발 ... 28
• 3. 조직내 교잡법을 이용한 돼지 전염성 위장병 진단법 개발 ... 30
• 4. 중합효소 연쇄반응과 면역 조직 화학법을 이용한 증식성 회장염 진단법 개발 ... 31
• 5. 중합효소 연쇄반응과 조직내 교잡법을 이용한 살모렐라증 진단법 개발 ... 32
• 6. 병리조직학적 검사를 이용한 콕시디윰 설사병의 진단법 체계화 ... 33
• 7. 중합효소 연쇄반응을 이용한 대장균성 설사병 진단법 체계화 ... 34
• 제3절 결과와 고찰 ... 36
• 1. 다중 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 유행성 설사병과 돼지 전염성 위장염의 감별 진단법 개발 ... 36
• 2. 조직내 교잡법을 이용한 돼지 유행성 설사병 진단법 개발 ... 37
• 3. 조직내 교잡법을 이용한 돼지 전염성 위장병 진단법 개발 ... 40
• 4. 중합효소 연쇄반응과 면역 조직 화학법을 이용한 증식성 회장염 진단법 개발 ... 43
• 5. 중합효소 연쇄반응과 면역 조직 화학법을 이용한 살모렐라증 진단법 개발 ... 43
• 6. 병리조직학적 검사를 이용한 콕시디윰 설사병의 진단법 체계화. ... 44
• 7. 중합효소 연쇄반응을 이용한 대장균성 설사병 진단법 체계화. ... 44
• 8. 포유자돈 설사병 발생분포 ... 50
• 9. 이유자돈, 육성돈, 비육돈 설사병 발생분포 ... 52
• 제3장 돼지 호흡기 질환 진단법 개발 ... 54
• 제1절 서 설 ... 54
• 제2절 재료 및 방법 ... 57
• 1. 비강 면봉에서 2단계 중합효소 연쇄반응을 이용한 위축성 비염의 진단법 ... 57
• 2. 병리조직학적 관찰과 조직내 교잡법을 이용한 마이코플라즈마성 폐렴의 진단법 개발 ... 58
• 3. 조직내 교잡법을 이용한 파스튜렐라성 폐렴의 진단법 개발 ... 60
• 4. 파스튜렐라균의 협막형 성상분석 및 항생제 감수성 검사 ... 61
• 제3절 결과와 고찰 ... 63
• 1. 비강 면봉에서 2단계 중합효소 연쇄반응을 이용한 위축성 비염의 진단법 ... 63
• 2. 병리조직학적 관찰과 조직내 교잡법을 이용한 마이코플라즈마성 폐렴의 진단법 개발 ... 64
• 3. 조직내 교잡법을 이용한 파스튜렐라성 폐렴의 진단법 개발 ... 65
• 4. 파스튜렐라균의 협막형 성상분석 및 항생제 감수성 검사 ... 66
• 5. 돼지 호흡기성 질병의 발생분포 ... 70
• 제4장 돼지 소모성 질병 진단법 개발 ... 71
• 제1절 서 설 ... 71
• 제2절 재료 및 방법 ... 74
• 1. 이유자돈 전신성 소모성 질환의 병리조직학적 검사법과 혼합 감염된 병원체 ... 74
• 2. 다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스 감별 진단법 ... 75
• 3. 파라핀 조직으로부터 돼지 써코바이러스 2형 검출을 위한 2단계 중합효소 연쇄반응 진단법 최적화 ... 76
• 4. 이중 조직내 교잡법을 이용한 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스에 대한 동시 진단법 ... 78
• 5. 2단계 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 콜레라 바이러스 진단법 개발 ... 81
• 6. 조직내 교잡법을 이용한 돼지 콜레라 바이러스 진단법 개발 ... 83
• 제3절 결과와 고찰 ... 85
• 1. 이유자돈 전신성 소모성 질환의 병리조직학적 검사법과 혼합 감염된 병원체 ... 85
• 2. 다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스 감별 진단법 ... 89
• 3. 파라핀 조직으로부터 돼지 써코바이러스 2형 검출을 위한 2단계 중합효소 연쇄반응 진단법 최적화 ... 90
• 4. 이중 조직내 교잡법을 이용한 돼지 써코바이러스 2형과 돼지 파보바이러스에 대한 동시 진단법 ... 93
• 5. 2단계 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 콜레라 바이러스 진단법 개발 ... 96
• 6. 조직내 교잡법을 이용한 돼지 콜레라 바이러스 진단법 개발 ... 96
• 제5장 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의 ... 99
• 제6장 인용문헌 ... 107
• 제1절 돼지 소화기 질환 진단법 개발 ... 107
• 제2절 돼지 호흡기 질환 진단법 개발 ... 114
• 제3절 돼지 소모성 질병 진단법 개발 ... 120
• 끝페이지 ... 128