초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
가. 유용미생물의 탐색 및 동정
공시 병원균과 길항균 선발. 병원균인 Botrytis cinerea LVF12 균주(이하 LVF12)는 부산시 강동지역의 들깨 재배하우스내에서 잎마름 증상 및 줄기 정단부의 잘록 증상의 들깨로부터 분리되어 문 등(1998)에 의해 잿빛곰팡이병균으로 확인된 균주이며, 길항균은 들깨잎과 근권토양에서 분리한 250 균주 중 균사생장 및 포자발아율 억제효과 그리고 생육상내 포트검정에서 방제효과가 가장 우수하였던 N1균주를 본 잿빛곰

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
1. 연구개발 결과
가. 유용미생물의 탐색 및 동정
공시 병원균과 길항균 선발. 병원균인 Botrytis cinerea LVF12 균주(이하 LVF12)는 부산시 강동지역의 들깨 재배하우스내에서 잎마름 증상 및 줄기 정단부의 잘록 증상의 들깨로부터 분리되어 문 등(1998)에 의해 잿빛곰팡이병균으로 확인된 균주이며, 길항균은 들깨잎과 근권토양에서 분리한 250 균주 중 균사생장 및 포자발아율 억제효과 그리고 생육상내 포트검정에서 방제효과가 가장 우수하였던 N1균주를 본 잿빛곰팡이병균에 대한 우수 길항균으로 최종 선발하였다.
길항균 동정. 최종 우수 길항균으로 선발된 길항세균 N1균주는 Bergey's manual에 따라 배양적, 생화학적, 생리적 특성을 조사하였으며, 형태는 전자전자현미경(TEM)으로 관찰하였고, 정확한 동정을 위하여 API system test와 16S rRNA 염기서열로 분석하였다. 그 결과, Gene bank data의 Bacillus licheniformis와 99% 이상 상동성을 보여 N1 균주는 Bacillus licheniformis로 최종 동정되었으며 2002년 8월 3일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10319BP).
길항균의 최적배양조건. 선발된 B. licheniformis N1 균주(이하 N1 균주)의 최적배양 조건을 확립하기 위해. 온도, pH, 배양시간, 교반속도, 탄소원과 질소원의 영향을 조사한 결과, 생장 적온은 30∼35℃였으며, pH는 NB배지에서 초기 pH가 5인 경우에, 비지배지에서는 초기 pH가 5와 5.5에서 세균밀도가 가장 높았으며, 최적 배양시간은 16시간내에 최고의 밀도에 도달하였고, 교반속도는 200, 300, 400rpm에서 모두 세균 생장에 아무런 영향을 미치지 않았다.
탄소원과 질소원을 각각 1% 첨가한 액체배지와 PDA평판배지에서 세균의 생장과 항생물질생산 정도를 조사한 결과, 세균의 생장정도는 탄소원이 옥수수전분, 질소원이 콩가루와 비지가루에서 세균밀도가 가장 높았으며, 항생물질 생산은 탄소원이 glucose, 질소원이 콩가루 또는 비지가루에서 균사억제 효과가 가장 우수하였다.
길항세균의 대량배양용 배지선발. 대량배양을 위해 미강, 밀기울, 옥수수 전분, 비지, 쌀 전분, 깻묵 등 시중에서 비교적 쉽게 구할 수 있고 가격이 저렴한 농가부산물을 이용하였는데, 플라스크배양에서는 비지배지에서 1.2X10⁹ cfu/㎖로 가장 세균밀도가 높았으며, 발효기내 대량배량에서도 비지배지에서 4X10¹¹ cfu/㎖로 높아 결국, 대량배양용 배지로 비지배지를 선발하였다. 비지는 현재 산업폐기물로 처리되고 있으므로 미생물농약 개발의 생산단가를 낮출 수가 있다.
나. 미생물농약의 개발
전달매체 선발. 전달매체로서 질석, 흙, 세라믹 등을 이용하여 만든 제제는 식물 처리 후 미관상 좋지 않으며 부착력도 떨어져 방제가도 낮았다. 따라서 본 연구에서는 식물성 고분자물질인 호박가루, 솔잎가루, 시금치가루, 밀가루, 쌀가루, 콩가루, 전분류등을 전달매체로하여 제제화하였는데 그 중 전분류에서 가장 효과가 좋았고 가격도 저렴하였으며 자외선 차단 및 잎 부착 정도가 높아 이를 우수전달매체로 선발하였다.
미생물농약의 제조. 대량배양용 비지배지에서 배양한 길항세균을 전달매체인 전분과 그리고 올리브기름 및 설탕 등과 혼합하여 3종의 제형으로 제조하였는데 수화제형 제제 11종, 유제형 2종 및 액제형 3종으로 제조하였다.
다. 미생물농약의 방제효과 검정 및 우수제형 선발
제조한 수화제형 11종, 유제형 2종 및 액제형 3종의 미생물농약을 공시작물인 토마토, 딸기, 결구상추의 생육상내 폿트, 하우스내 폿트, 하우스내 토경재배에서 방제효과를 검정하고 각 작물에 적합한 우수제형을 최종 선발하였다.
생육상내 폿트검정에서는 3종의 작물에서 제조한 11종 수화제형 미생물농약 중 효과가 우수한 두가지 제형만을 선발하고, 하우스내 폿트검정에서는 선발된 2종의 수화제형(N1K와 N1E제제)과 새로 제조한 3종의 액제형(N1W1, N1W2, N1W3제제) 및 2종의 유제형(N1O1, N1O2제제)을 제형별로 처리하여 각 작물에서 우수한 제형을 선발하였다. 그 결과, 토마토와 딸기에서는 공통적으로 수화제형 N1E와 액제형 N1W3제제가, 결구상추에서는 수화제형 N1K와 N1E제제가 화학농약과 유제형보다 방제가가 높아 우수제형으로 일차 선발되었다.
선발된 우수 제형들의 경시적 방제효과를 검정한 결과, 토마토의 N1E, N1W3제제와 화학농약은 모두 11일까지 90.0% 이상의 높은 방제가를 유지하였고, 20일 째에는 N1E제제가 N1W3제제와 화학농약보다 높은 방제가로 유지하였으며, 딸기의 N1E, N1W3제제 및 화학농약은 처리 17일후까지도 90% 이상의 높은 방제가가 유지되었으나, 20일째에는 85%로 다소 낮아졌으나 여전히 높은 방제가를 유지하였으며 화학농약은 약간 감소하였다. 결구상추의 N1K제제는 7일 후에 N1E제제보다 높게 유지되었으나, 6주 후에는 다소 낮아졌으며, 화학농약은 매우 낮은 방제가로 유지되었다.
따라서, 두가지 선발된 우수제형들을 하우스내 토경재배에서 검정하고 최종적으로 한가지의 제형만을 선발하였는데, 앞서의 생육상내 폿트검정, 하우스내 폿트검정과 동일한 결과로 토마토, 딸기 잿빛곰팡이 방제용 미생물농약으로는 수화제형 N1E제제가, 결구상추 방제용으로는 수화제형 N1K제제가 최종 우수제형으로 선발되었다.
라. 선발 미생물농약의 포장적용을 위한 폿트내 최적화시험과 하우스내 토경재배 작물에서의 적용시험
3종의 작물에서 최종 선발된 수화제형 N1E와 N1K제제의 폿트내 최적화시험에서 다른 제제의 형태와 처리방법으로 방제효과를 검증하여 하우스내 토경재배 작물에 적용코자하였다.
첫째로, 항균활성이 있는 B. stearothermophilus P-4-2 균주, B. megaterium N4 균주, B. subtilis BS 균주를 각각 수화제형 P-4-2, N4 및 BS제제로 제조하고, 선발된 N1E, N1K제제와 단수 또는 복수로 처리하였는데, 단수로 처리한 N1E, N1K제제가 P-4-2, N4 및 BS제제와 조합한 모든 복수제제보다 방제가가 높아, 3종 작물에서 복수제제는 기존의 단수제제의 방제효과를 제고시키지 못하였다.
둘째로, N1 균주 배양액의 균체로만 제조한 집균제제(CF), 항생물질층으로 제조한 항생물질제제(SF), 그리고 배양액 전부로 제조한 혼합제제(N1E 및 N1K제제)의 방제효과를 비교하였는데, 배양액 전부로 제조한 혼합제제가 집균제제와 항생물질제제보다 방제가가 높아 3종 작물의 모든 포장적용실험에 혼합제제인 N1E제제, N1K제제만을 사용하였다.
세째로, N1E, N1K제제를 처리농도별로 각각 25, 50, 100, 200, 400, 800배 희석하여 방제효과를 검정하였는데, 이중에서 25배와 50배 희석액에서 방제가는 가장 높았으나, 단위면적 당 제제 처리량이 많이 소비되므로, 그 다음으로 높은 방제가를 보인 100배 희석액을 최적농도로 결정하였고. 최적 처리시기는 병원균 접종 1일 전에, 미생물농약의 최적 처리횟수는 4주 이내에 1회 처리가 가장 적합하여 이 결과를 토경재배한 각 3종의 작물에 적용하여 검정한 결과, 최적 처리농도와 최적 처리시기는 각각 100배 희석액과 병원균 접종 1일전 처리로 최적화시험과 동일하였으나, 최적 처리횟수는 최적화시험에서와 달리 한달내에 7일간격 3회 살포가 가장 적합하였다.
상기의 최적화 시험에서 결정된 모든 적용조건으로 수화제형 N1E와 N1K제제를 농가하우스와 유사한 하우스내 토경재배 작물에 처리하여 3주 동안 화학농약과 비교 검정한 결과, 토마토와 딸기 방제용 N1E제제는 3주 후 방제가가 각각 90%, 83.5%인 반면, 화학농약은 각각 79.5%와 75.9%로 낮았으며, 결구상추 방제용 N1K는 3주 후에 84.1%의 방제가로 화학농약의 방제가 54.3%보다 현저히 높아, 하우스내 폿트검정과 동일하였으며 미생물농약의 방제효과가 우수함을 확인하였다.
자연발병된 농가하우스에 적용할 목적으로 N1E, N1K수화제를 화학농약과 교차 및 혼용 시용하여 방제효과를 검정하였는데, 토마토, 딸기, 결구상추의 3종 작물에 공통적으로 미생물농약 단독처리에서 방제가가 가장 높았으며 다음으로는 미생물농약과 화학농약의 교차처리, 미생물농약과 화학농약의 혼용처리, 화학농약단독처리의 순이었으므로, 자연발병 농가하우스의 포장 검정에 재차 적용하여 실제농가에서 적용될 수 있는 처리방법을 제시하기로 하였다.
바. 선발미생물농약의 자연발병된 농가하우스에서의 포장검정
최종선발된 수화제형 N1E와 N1K제제의 자연발병된 농가하우스에서의 포장검정에서 토마토, 딸기, 결구상추에 공통적으로 미생물농약이 화학농약보다 방제효과가 우수하였는데, 토마토에서의 N1E제제는 90.5%로 디에토펜카브․가벤다수화제의 77.0% 보다 우수하였으며, 딸기에서 N1E제제는 82.0%로 이프로수화제의 61.2% 보다도 월등히 우수하였으며 서로간에 유의차가 있었고, 결구상추 역시 N1K제제처리가 90.3%로 프로파수화제의 69.5%보다 현저히 우수하여, 하우스내 토경재배 검정과 일치하는 결과였다. 미생물농약의 최적 처리농도는 100배 희석액으로, 최적 처리시기는 병원균 접종 1일 전에, 미생물농약의 최적 처리횟수는 7일간격 3회 살포로 선발되었으며, 또한, 미생물농약과 화학농약의 교차 및 혼용시용 검정에서, 미생물농약 단독처리가 가장 우수하였고 다음으로는 화학농약과의 교차 및 혼용처리가 높고 화학농약 단독처리는 가장 방제가가 낮아, 미생물농약과 화학농약을 교차 또는 혼용시용하는것이 화학농약만을 처리하는 경우보다 방제효과를 제고시켜 경제적, 환경적인 측면에서 중요하였으며, 실제농가에서도 미생물농약을 단독처리하거나 화학농약과 미생물농약을 교차 또는 혼용 처리할 것을 권장하여 이를 적용할 수 있도록 처리방법을 제시하였다.
사. 선발미생물농약의 작물에서의 활성, 저장안정성, 약해 검정 및 물성 조사
하우스내 토경재배한 작물에서의 활성 검정. 하우스내 토경재배한 각 작물에 수화제형 N1E와 N1K 제제의 활성 검정을 위해, rifampicin 저항성 균주로 유도된 B. licheniformis RN1 균주로 RN1E, RN1K수화제를 제조하고 각 작물의 잎과 열매에 제제 1회 처리 후 4주 동안 RN1 균주의 생존율을 조사하였는데, 토마토 잎에 처리한 RN1E제제의 초기 세균수는 3.1×10¹⁰cfu/㎖로, 처리 28일 후에 3.7×104 cfu/㎖로 유지되었고, 열매에서는 초기세균수 5.0×10¹⁰cfu/㎖가 6.2×10⁹cfu/㎖로 유지되었으며, 딸기 잎과 열매에서는 RN1E제제의 초기 세균수인 3.1×10¹⁰cfu/㎖에서 각각 7.4×10⁶cfu/㎖와 2.8×10⁷cfu/㎖로 유지되었다. 하지만, 결구 상추에 적용된 RN1K제제의 초기 세균수는 4.7×10¹²cfu/㎖로서 28일 후에 3.0×10⁸ cfu/㎖로 장기간 제제의 높은 효과가 유지되었다.
저장안정성 검정. 수화제형 N1E 제제의 온도 차이에 따른 저장 안정성 조사를 위해 2001년 1월부터 2002년 4월까지 1년 4개월 동안 냉장실(4℃), Incubator(10℃), 배양실(25℃), 상온(실온)에 각 제제를 두고 매월 동일한 날짜에 제제내에 포함되어 있는 세균수를 조사한 결과, 최초 세균수 7.5X10¹¹ cfu/㎖에서 1년 4개월이 경과하는 동안 4℃에 보관한 제제의 경우 6.0X10¹⁰ cfu/㎖로서 매우 높은 수치의 세균수가 유지되어 매우 안정성이 높았다. 하지만, 다음은 10℃, 25℃, 상온의 순서로 세균수가 낮았다. 따라서 미생물 농약의 보관은 4℃ 냉장보관이 가장 효과적이었다.
식물에 대한 약해 검정. 수화제형 N1E제제의 식물에 대한 약해 조사를 위해 공시작물인 토마토, 딸기, 결구상추 3종 외에 오이, 콩, 고추, 바랭이, 쇠비름 등의 육상식물 5종, 미나리, 좀개구리밥, 벼 등의 수생식물 3종을 선발하여 제제 최적농도인 100배와 배량인 50배로 제제를 살포하고 3일 및 7일후에 경엽과 과일에 나타나는 약해유무를 달관 조사하였다. 그 결과 기준량과 배량 모두 11종의 작물에서 약해증상은 없었다.
물성 조사
팽윤도. 수화제형 미생물농약은 농가의 하우스 또는 포장 살포시 물과 같은 용매에 의해 쉽게 팽창되어 분무기 사용에 난점을 초래하므로, 선발제제의 팽윤도를 조사하여 약제 살포의 난이도를 결정하고자 하였다. N1E와 N1K제제를 20배(5%), 10배(10%), 5배(20%)로 수돗물에 희석하여 10분, 30분 그리고 1시간동안 방치하여 분무기를 통과할 수 있는 난이도를 측정하였다. 그 결과, 5%와 10%로 희석한 제제는 분무에 아무런 문제가 없이 순조로웠지만, 20%로 희석한 수화제는 분무시간 10분 후부터 통과에 어려움이 있는 것으로 나타나 분무기를 통과하는 수화제형의 살포성은 제제의 희석농도와 방치시간 그리고 팽윤도와 깊은 상관관계가 있어 효과적인 분무 살포를 위해서는 미생물농약 수화제를 10%이내로 희석하여 30분 이상 방치하지 않도록 하여야 한다.
흡습도. 수화제형 N1E와 N1K제제의 자체 수분 흡수능력을 조사하여 응고와 변질에 대한 보관상의 문제점을 구명하기 위하여 수분 측정기를 이용하여 조사하였다. 습도가 높은 생육상(습도 90%이상, 온도 20℃), 실험실(습도 56%, 실온), 냉장실(습도 24%, 온도 4℃), 하우스(습도 65%, 온도 25±5℃)에 시료를 방치한 다음 수분 함량을 측정한 결과, N1E와 N1K의 초기수분량은 10.0%였으나, 냉장실(4℃) 보관 시에 24시간 후 수분량은 각각 11.2%, 12.7%로서 초기 수분량과 비슷하여 수분함량의 변화가 가장 낮아 제제의 보관은 4℃가 가장 적합하였다.
수중 유효성분의 확산성. 물에서의 확산성을 확인하기 위해 수화제형 N1E와 N1K제제를 각각 1배, 10배, 100배로 희석하여 각각 270, 325, 400 mesh의 체에 걸러진 통과량과 체 위에 잔존하는 제제의 건중량을 측정하여 통과율을 조사하였다. 미생물농약 등록기준은 325 mesh의 97%이상 통과율이면 가능한데, 두 제제 모두 체의 mesh에 상관없이 최적 처리농도인 100배 희석 뿐만 아니라 10배 희석액에서도 90% 이상의 통과율을 보여 농약살포기를 통한 분무 살포시 큰 어려움이 없는 것으로 조사되었다.
아. 저장성과일 방제용 미생물농약 선발과 적용시험
병원균 접종원 및 접종농도. 수화제형 N1E와 N1K제제를 저장성열매방제용으로 적용가능한지 검토하기 위해 3종의 과일에서의 가장 효과적인 병원균 접종방법과 농도를 선발한 결과, 외부영양원으로서 0.1M KH2PO4를 첨가한 30% tomato juice를 이용한 분생포자 부유액을 접종원으로 하고 1×10⁷ conidia/㎖를 최적 접종 농도로 정하였다.
저장성 과일용 제제 선발. N1E 및 N1K제제를 토마토, 사과, 배 등의 저장성 과일에 처리하고 잿빛곰팡이병에 의한 썩음병 방제효과를 검정하여 우수 제제를 선발한 결과, 토마토와 사과에서는 N1E 제제가, 배에서는 N1K제제가 가장 우수하였으나 공시 3종 과일에서 고르게 방제효과가 우수하였던 N1E 수화제를 저장성 과일 처리용 미생물농약으로 최종 선발하였다.
최적 처리농도 검정. 최종 선발된 N1E제제를 100배, 200배, 500배로 희석하여 과일별로 처리하고 병원균을 접종한 후, 7일 후에 병반 직경을 조사하여 최적처리농도를 선발한 결과, 토마토, 배, 사과 모두 100배 희석액 처리한 구에서 가장 방제효과가 높아 100배 희석액을 최적처리농도로 선발하였다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results and proposal practical use of research
Occurrence of gray mold rot by pathogen, Botrytis cinerea, which is mainly caused at the high moisture condition in the plastic houses, have been causing great damages in the quantity and quality of commercial crops. Several chemical fungicides ha

Ⅳ. Results and proposal practical use of research
Occurrence of gray mold rot by pathogen, Botrytis cinerea, which is mainly caused at the high moisture condition in the plastic houses, have been causing great damages in the quantity and quality of commercial crops. Several chemical fungicides have been using to control the disease, although showing no satisfied results and causing more problems. Nowadays, more safe and promising methods of disease control are strongly requesting for the safe production. Thus, this study was conducted to develop new biofungicide using Bacillus licheniformis N1 for the biological control, and the suppressive effect of the biofungicide for gray mold rot was investigated in a growth chamber, plastic house, and the fields naturally occurred gray mold rot. Besides, developed biofungicide in this study were applied to the three kind of fruits for the post harvest control to the decay by B. cinerea in cold restoration.
An antagonistic bacteria, B. licheniformis N1 strain which effectively inhibited mycelial growth of gray mold rot pathogen, B. cinerea LVF 12 was isolated from the rhizosphere of perilla crop in Kangdong, Busan, Korea.
The biofungicide was formulated by 7 different formulation categorized into 3 different groups such as wettable powder(WP), liquid concentrate(LC), and emulsified concentrate(EC). also, the suppressive effect of each formulation against tomato, strawberry, and head lettuce gray mold rot was respectively investigated in a growth chamber and in a plastic house.
For the mass production of active antifungal ingredients of B. licheniformis N1 strain in flask liquid culture, the most effective carbon and nitrogen source were selected as glucose and tryptone, respectively.
For the 11 wettable powder(WP), vegetative biomass of B. licheniformis N1 strain from 5-day-old fermentation culture in biji broth medium for the mass-production, was mixed with the different concentration of corn starch, olive oil and sugar and then dried and pulverized.
For the 3 soluble concentrates(SC) and 2 emulsifiable concentrates(EC), vegetative biomass of B. licheniformis N1 strain from fermentation culture in biji broth medium, was mixed with different concentrations of corn starch, olive oil, sugar, and alcohol, respectively.
Among developed fungicides, the most suitable formulation for the tomato, strawberry and head lettuce were selected as the N1E and N1K formulation under the growth chamber, pots, plastic house, and fields experiments which showed the significantly higher control values than those of chemical fungicide.
Also, N1E and N1K formulation was applied to decay by B. cinerea on the post harvest fruits in cold restoration. N1E formulation was selected most effectual biofungicide for the post harvest control.
In conclusion, this technology will be transferred to domestic companies to make commercial products, which will protect plants from pathogenic diseases and increase the crop yield.