초록 ▼

○ 연구결과
1 원료물질 표준화 및 연구최적 체제화를 위한 생산 공정
- 115종의 천연자원을 분양 받아 agar diffusion test 법에 의하여 항균 실험을 수행한 결과 천산용이 강한 항균활성을 보였다
- 이 분획을 activity directed separation 방법에 따라 확인한 결과 활성물질이 protodioscin임을 규명 하였고, 추출 공정의 간소화로 인해 쉽고 빠르게 protodioscin을 분리할 수 있다.
- 감귤잎에 자생하는 미생물 중 항균활성이 강한 미생물(603)을 분리 동정하고

○ 연구결과
1 원료물질 표준화 및 연구최적 체제화를 위한 생산 공정
- 115종의 천연자원을 분양 받아 agar diffusion test 법에 의하여 항균 실험을 수행한 결과 천산용이 강한 항균활성을 보였다
- 이 분획을 activity directed separation 방법에 따라 확인한 결과 활성물질이 protodioscin임을 규명 하였고, 추출 공정의 간소화로 인해 쉽고 빠르게 protodioscin을 분리할 수 있다.
- 감귤잎에 자생하는 미생물 중 항균활성이 강한 미생물(603)을 분리 동정하고 최적 배양조건을 확립하고 유용물질의 대량생산하였다.
2 in vitro 유효성 평가 test
- 식물추출물의 구조 분석을 통해 protodioscin임을 밝혔고, protodioscin 표준물질과 각 조건별 항균활성 비교평가를 실시한 결과 큰 차이를 보이지 않았다.
- protodioscin의 병인별 항균효과를 확인한 결과 1000 ppm 농도에서 시들음병원균인 Fusalium oxysporum에서만 5%의 효과가 있었다. Protodioscin의 타 작물에 대한 방제효과는 기대하기 어렵다.
3 허가등록 시험
- 감귤의 일정 부위에 상처를 입힌 후 P. digitatum과 P. italicum에 대한 방제 효과 실험에서 protodioscin의 항균효과는 400 ppm에서 높은 방제 효과를 나타내었으면 그 이상의 농도에서도 약해가 발생하지 않았다.
- 보조제는 분산제로 tween 20을 사용하고 점착제로 xanthan gum을 사용하였다. 보조제를 첨가한 이 후에도 protodioscin의 항균활성에 변화를 주지 않았다.
4 항곰팡이 작용기작 평가시스템 개발
- Protodioscin, B. velezensis 603, B. vietnamiensis RB2의 항균활성 기작을 확인해본 결과 활성물질 및 균주에 의해 P. digitatum은 균사의 팽윤, 용균, 비대증식, 세포벽 분해, 세포막 분해 등의 현상이 나타나면서 생장을 억제시킨다.
5 유효추출물 성분연구
- 감귤의 잎에서 분리 동정된 B. velezensis 603균주로부터 생성되는 유효 성분은 itrulin 5이었다.
P. digitatum 균을 1x1055 cfu /ml로 감귤에 처리하고 7시간 후 균주 배양여액을 처리한 예비실증실험에서 67%의 방제 효과를 나타내었다.
- 603균주의 적용 범위를 확인한 결과 alternnaria solani를 비롯한 7개의 식물 병원균에서 강력한 균사 억제 효과를 확인할 수 있었다.
6 제제 및 제형화 확립
- protodioscin과 603 균주의 여액을 조합된 물질의 항균 활성을 조사한 결과 protodioscin 단독 처리시 보다 4배의 강력한 항균활성을 나타내었다.
7 안전성 및 안정성 평가
- 효과를 나타내는 protodioscin 농도에서 사용시 안전성을 세포 독성 실험과 급성독성 시험을 통하여 확인하였다. 또한 유통 상에서의 안정성을 확인하기 위하여 열, 산도 및 자외선에 대한 안정성을 확인하였다. 그 결과 protodioscin은 안전성과 안정성에 문제가 없는 것으로 판명되었다.
8 시제품 생산
- Protodioscin과 603균주의 배양여액, 그리고 보조제의 최적 배합을 통해 시제품을 개발하였다.
9 실증시험
- 실증 실험에서는 기상 이변 등의 원인으로 기대에 못 미치는 효과를 나타내었으나 예비현장실험에서의 결과로 보아 상업화 가능성이 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼

As in citrus, it takes above 1 month from citrus farm to customers. In this process, citrus get wounded. From these wounds, fungi such as P. digitatum and P. italicum were occurred within 1 week. During these processes, lose rate of citrus was 10 ~ 30%. This make ecrement of productivity of citrus.

As in citrus, it takes above 1 month from citrus farm to customers. In this process, citrus get wounded. From these wounds, fungi such as P. digitatum and P. italicum were occurred within 1 week. During these processes, lose rate of citrus was 10 ~ 30%. This make ecrement of productivity of citrus. So we performed this study to solve problems in the process of storages of citrus.
First of all, we isolated P. digitatum and P. italicum from leaf of citrus and identified and then characterized. We performed basic antibiotic activity of 5 species of storage related microbes donated from KACC.
We tested antifungal effect of the 115 plant extracts using agar diffusion test. The 115 species of plants were donated from Chungnam Nation university and related institution. Dioscorea quinqueloba Thunb. extract showed the most effective in the test. It assumed that antifungal mechanisms of Dioscorea quinqueloba Thunb. are as bellows; 1) swelling of spawn and hypertrophy 2) extraordinary branching 3) germinating inhibition of spore.
From this on, We tested antifungal effect of subdivided extract of Dioscorea quinqueloba
Thunb. and it showed that butanol fraction was most potent of the subdivide extract.
According to the activity directed separation method, the fraction was separated using silica column and LH-20 column. And Rf value on the spot of TLC was checked. Finally, we determined the protodioscin by using 1H-, 13C NMR analysis. After that we established the mass exaction - purification method for commercial use of protodioscin.
We performed the pre field test before the field test afterward. By using needles, we stabbed the certain part of citrus. After that we infected P. digitatum and P. italicum. 7 hours late, we sprayed the various concentration of protodioscin. As a result, it was most potent at the concentration of 400 ppm protodioscin and phytotoxicity was not shown above this concentration.
We tested stability and safety on the concentration of most effect range of protodioscin. It showed that no cytotoxicity and no acute toxicity in this test. For the purpose of stability on the distribution periods, we tested the pH stability, heat stability and protecting effect of UV ray irradiation. The stabilities of above matters were qualified by this test. We used supplemental agent for settled effect of protodioscin. We chose tween 20 for deflocculator and xanthan gum for sticking agent. It showed no harmful effect by using supplemental agent. For antifungal spectrum of protodioscin, we test various microbes on protodioscin. It showed no effect on various microbes except P. digitatum and P. italicum.
We thought that microbes living on the leaf of citrus are effective on storage disease. So we isolated and identified the microbes living on the leaf of citrus and we found the 603 species which have potent antifungal activity. From this species, we isolated itrulin 5 in the filtrate of growth media. In the antifungal pre field test, we treated P. digitatum of 1x 105 cfu/ml. As a result, it showed 67% of antifungal effect. In addition, antifungal spectrum of various microbes, it showed potent effective antifungal activity on 7 plant microbes including Alternnaria solani.
We examined the combinational treatment of 603 species and extract of Dioscorea quinqueloba Thunb. on antifungal activity. As a result, it showed 70% of antifungal activity in the combinational treatment of filtrate of growth media of 603 media and 100 ppm of plant extract. It is more potent than protodioscin alone treatment by 4 times.
In the bases of these results, we tested phased field test in citrus test site located in Jeju Island. It showed no effect because the climate condition in previous 2 years is somewhat different from average climate. However, as the result of pre field test, we conformed antifungal activity in near future. These results were filed 2 cases on patent application and applied to 4 issue to scientific journal includes plant pathology journal as titled 'Practical Application of Dioscorea quinqueloba Thunb. Extract as a Biological Control Agent'. As results, we think that it has potent antifungal activity on citrus by combining material of filtrate on growth media of 603 species and extract of Dioscorea quinqueloba Thunb. and the great possibility of commercial usage.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 8
• 목 차 ... 10
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 12
• 제1절 연구의 목적 ... 12
• 1. 연구배경 ... 12
• 2. 년차별 연구개발 내용 및 범위 ... 14
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 15
• 1. 기술개발의 필요성 ... 15
• 제3절 연구개발의 추진체계 ... 16
• 1. 연구개발의 추진전략 ... 16
• 2. 연구개발의 추진체계 ... 17
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 18
• 제1절 생산 및 시장 현황 ... 18
• 1.국내 관련(유사)제품의 생산 및 시장 현황 ... 18
• 2. 국외 관련(유사)제품의 생산 및 시장 현황 ... 20
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 22
• 제1절 재료 및 연구 방법 ... 22
• 1. 병원균의 분리 및 확보 ... 22
• 2. 천연물 농약으로 이용 가능한 유용물질 탐색 및 선발 ... 22
• 3. 감귤을 이용한 항균 활성 검정 ... 26
• 4. 유용물질의 안전성 및 안정성 확인 ... 28
• 제2절 결과 ... 32
• 1. 저장병 원인대상병원균 동정 ... 32
• 2. 식물추출물의 선별 및 대량 생산 ... 34
• 3. 유용균의 선별 ... 51
• 4. 미생물 농약으로 이용 가능한 유용세균의 추가 선발 및 동정 ... 57
• 5. 감귤저장병의 현장평가를 위한 길항미생물의 선정 ... 62
• 6. 약효증진용 보조제의 탐색 ... 64
• 7. 천연물질의 감귤 녹색곰팡이병 방제효과 ... 66
• 8. 실내 상처접종 실험을 통한 길항 내생세균의 활성 검정 ... 71
• 9. 다양한 조합을 통한 효과적인 방제 방법 ... 73
• 10. 시제품 제작 ... 78
• 11. 저장병 방제용 천연물농약의 포장적용 시험 ... 79
• 12. 안전성 및안정성 평가 ... 81
• 13. Protodioscin의 병인별 항균능력 조사 ... 95
• 제4장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 100
• 제1절 연구개발목표의 달성도 ... 100
• 1. 1차년도 ... 100
• 2. 2차년도 ... 101
• 3. 3차년도 ... 102
• 제2절 관련분야 기대효과 ... 103
• 1. 기술적 측면 ... 103
• 2. 경제적․산업적 측면 ... 103
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 105
• 제1절 연구개발 실적 ... 105
• 1. 특허 출원 ... 105
• 2. 연구 논문 발표 준비 ... 105
• 3. 인력양성 ... 105
• 제2절 기업화 추진 방향 ... 108
• 1. 사업화 계획 ... 108
• 2. 추가연구의 필요성 ... 108
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 109
• 제7장 참고문헌 ... 110
• 끝페이지 ... 115