초록 ▼

○ 연구결과
실험을 수행하기 위하여 본 연구실에서 분리 및 동정한 다양한 Methylobacterium 균주들 중 ACC deaminase 활성 및 식물생장촉진능이 뛰어난 7종의 Methylobacterium 균주들을 선발하여, Methylobacterium 접종에 따른 작물의 생육 증진 효과를 규명하기 위해 온실실험을 수행하였다. 각각 선발한 Methylobacterium 균주 접종에 의한 토마토와 고추의 지상부 및 뿌리 길이를 측정한 결과 대부분의 균주 처리구에서 대조구 대비 유의성 있는 길이 증진 효과를 확인 할 수 있었

○ 연구결과
실험을 수행하기 위하여 본 연구실에서 분리 및 동정한 다양한 Methylobacterium 균주들 중 ACC deaminase 활성 및 식물생장촉진능이 뛰어난 7종의 Methylobacterium 균주들을 선발하여, Methylobacterium 접종에 따른 작물의 생육 증진 효과를 규명하기 위해 온실실험을 수행하였다. 각각 선발한 Methylobacterium 균주 접종에 의한 토마토와 고추의 지상부 및 뿌리 길이를 측정한 결과 대부분의 균주 처리구에서 대조구 대비 유의성 있는 길이 증진 효과를 확인 할 수 있었으며,각 작물의 지상부 및 지하부 건물중 또한 이와 유사한 결과를 확인 할 수 있었다.또한 온실실험 수행중 토마토와 고추 잎의 에틸렌 발생량과 수확 후 전체 식물체의 에틸렌 발생량을 측정 한 결과 Methylobacterium 균주 처리구에서 유의성 있는 에틸렌 저감 효과를 확인 하였으며,이러한 결과를 바탕으로 식물생장촉진능과 에틸렌 제어 효과가 뛰어난 4종의 Methylobacterium을 병원균 기내 실험을 위해 선발하였다.
세균성 점무늬병,세균성 풋마름병 및 역병에 감염된 토마토와 고추 잎에서 ACC deaminase를 생산하는 Methylobacterium 균주들의 접종이 각각 병원균의 병증과 에틸렌 발생량에 미치는 영향을 확인하기 위해서 기내 실험을 수행하였다.선발된 4종의 Methylobacterium 균주들은 각각의 병원균에 대한 길항성은 없는 것으로 실험을 통해 나타났으나,병원균에 감염된 토마토와 고추의 잎에서 유의성 있는 병증의 감소를 확인 할 수 있었다.또한 병원균 감염에 의한 토마토와 고추 잎의 스트레스 에틸렌 수준을 측정한 결과 Methylobacterium 균주들을 접종한 처리구에서 병원균 단일 접종처리구에 비해 확연한 저감효과를 나타내는 것으로 확인 되었다.
기내 실험을 바탕으로 세균성 점무늬병과 세균성 풋마름병에 감염된 토마토와 고추에서 4종의 Methylobacterium 균주의 접종 효과를 확인하기 위하여 온실실험을 수행하였다.Methylobacterium 균주들의 접종효과는 세균성 병원균에 노출된 작물의 생장,병증의 발생,에틸렌 발생량 및 에틸렌 생합성에 관여하는 효소 활성을 비교함으로써 확인하였다.또한 미생물의 접종이 작물의 병원균방어효소 발현량과 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 규명하였다.그에 더하여 미생물 처리 효과를 과학적으로 규명하기 위해 유전자 조작 기술을 이용한 형광 표지 및 이를 이용한 작물 내 미생물의 군집을 확인하였다.각각의 병원균에 노출된 토마토와 고추에서 Methylobacterium 균주의 접종은 병원균 단일 접종 처리구에 비해 작물의 생장촉진 뿐 아니라 스트레스 수준의 에틸렌 발생과 그에 관여하는 ACC와 ACO의 저감 효과를 가져왔으며,그로 인해 병원균에 의한 병증이 확연히 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.이는 작물에 축적된 ACC가 Methylobacterium이 생산하는 ACC deaminase에 의해 α-ketobutyrate와 ammonia로 가수분해 되기 때문이다.그에 더하여 작물의 병원균방어효소 (β-1,3-glucanase,PAL,PO,PPO)발현량 및 관련 유전자 발현을 확인한 결과에서도 Methylobacterium 균주 접종 처리구에서 유의성 있는 증가를 확인 할 수 있었다.또한 형광 표지를 이용하여 Methylobacterium 균주들이 작물체내에 군집하면서 작물의 저항성을 향상시켰다는 결과를 확인 할 수 있었다.
미생물 효능 규명을 위한 식물생장촉진 미생물의 형광표지를 삽입하고 도입된 형광표지 유전자의 안정성을 검정하였다.이때 사용된 유전자는 gusA,nptII,gfp유전자가 minitransposon에 들어있어서 형질전환 된 미생물의 염색체에 들어감으로 인하여 안정한 형태로 존재하는 특성을 가지고 있었다.형질전환 후 계대를 통한 안정성 검정에서 세대가 거듭하여도 안정적으로 지속되는 것을 확인하였다.다음으로 식물생장촉진 미생물의 작물 내 분포 및 생존율 측정을 하였다.형질전환 된 미생물을 고추,벼,상추,토마토,시금치에 종자침지 하였다.미생물의 분포를 분석하기 위해 CLSM 으로 측정결과 미생물들이 주로 뿌리부분에 분포하는 것을 알 수 있었다.또한 고추와 상추에서 식물생장촉진 미생물이 뿌리 길이신장에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.
미생물의 접종이 병 관련 유전자인 PR 유전자 및 병원균방어효소 유전자 발현에 미치는 영향을 규명하였다. 고추에 식물생장촉진 미생물을 종자침지 하여 유묘기에 병원균인 역병균을 감염시켰다. 무처리군와 미생물 처리군,역병균 감염군,역병균 감염 후 미생물 처리군으로 실험하였다.PR 유전자인 ACC-oxidase와 PAL 유전자의 발현량을 Real-timePCR 로 검정한 결과 역병균 감염 후 미생물 처리군에서 발현량이 증대됨을 알 수 있었다. 결과적으로 식물생장촉진 미생물인 Methylobacterium 속 미생물은 특정 작물에서 뿌리생장촉진에 영향을 미치며 병원균이 감염되었을시 신호전달과정을 통하여 병원균에 저항하는 물질을 생산하도록 유도한다는 것을 알 수 있었다.
유박,퇴비,석회 처리 및 형질전환 Methylobacterium 접종이 고추의 생장에 미치는 영향을 확인한 결과,고추 초장의 경우 유박 100%,퇴비 300%,석회 200%,균주 접종 처리구가 가장 높았으며, 고추 건물중의 경우는 유박 100%,퇴비 300%,석회 100%,균주접종 처리구와 유박 100%,퇴비 300%,석회 200%,균주 접종 처리구에서 가장 높게 나타났다.고추의 근권과 잎에서 균밀도를 확인한 결과,근권의 경우 퇴비와 석회 처리량,잎은 퇴비의 처리량이 형질전환 Methylobacterium의 균밀도에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다.
M.oryzaeCBMB20의 근권접종과 메탄올 엽면살포에 따른 고추의 생육촉진 효과를 유기질 비료의 시용 수준별로 조사한 결과,M.oryzaeCBMB20의 근권접종과 메탄올 엽면살포는 각기 고추생육을 증대시켰으며,이들을 동시에 혼합 처리하였을 경우에는 고추의 생장촉진 효과가 더욱 현저하게 나타났다.M.oryzaeCBMB20와 메탄올을 혼합 처리한 경우 권장시비수준 100%와 300% 처리사이에 고추생육과 수량에서 유의성 있는 차이가 없었다.
두 가지 시험상토 (바로커 범용,명품골드)에서 Methylobacterium 접종에 따른 배추,고추 유묘의 생장을 측정하였다.배추의 경우 바로커 범용 상토에서는 CBMB12를 접종한 처리구에서 가장 높은 생장을 보였으며,명품골드 상토에서는 균주 접종에 따른 차이를 확인할 수 없었다.두 상토에서 균주 접종에 따른 고추의 생육을 측정한 결과,바로커 범용 상토에서는 CBMB12를 접종한 처리구에서 고추의 생육이 가장 높았으며,명품골드 상토에서는 CBMB12와 CBMB27을 접종한 처리구에서 고추의 생장이 가장 높게 나타났다.
따라서 건전육묘 생산 및 병원균에 대한 작물의 방어반응 유도를 향상시키기 위해 본 균주의 활용이 가능하리라 사료되며,향후 실제 농가 활용을 위해 에틸렌 민감 작물뿐 아니라 다양한 작물과 다양한 병원균을 이용한 필드 실험이 수행될 예정이다.

Abstract ▼

Biosynthesis of ethylene is usually enhanced with severity of pathogenic infection. Some ethylene synthesis inhibitors are known to significantly decrease the severity of pathogen infections in plants. Methylotrophic bacteria have been found to stimulate plant growth and regulate ethylene emission i

Biosynthesis of ethylene is usually enhanced with severity of pathogenic infection. Some ethylene synthesis inhibitors are known to significantly decrease the severity of pathogen infections in plants. Methylotrophic bacteria have been found to stimulate plant growth and regulate ethylene emission in crop plants. A selective decrease of ethylene can be achieved by plant growth promoting bacteria, for instance Methylobacterium, producing ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) deaminase, which cleaves ACC into α-ketobutyrate and ammonia in higher plants. This study was conducted to examine the effect of Methylobacterium inoculation on seedling development and ethylene emission in tomato and red pepper plants under greenhouse condition. Methylobacterium inoculation increased significantly seedling development and reduced the ethylene emission of tomato and red pepper plants Bacterial inoculation reduced ethylene emission in tomato and red pepper leaves infected with bacterial spot (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), bacterial wilt (Ralstonia solanacearum) and Phytophthora blight (Phytophthora capsici). Although the Methylobacterium strains did not show antagonistic effects against the phytopathogens under in vitro condition, they accumulated the antimicrobial compound salicylic acid in culture medium. Tomato and red pepper leaves treated with Methylobacterium strains showed significantly reduced disease incidence and lowered ethylene emission. Bacterial salicylic acid production confers enhanced disease resistance in inoculated plants lowered ethylene emission and growth promotion. In greenhouse experiments, the disease index value observed in Methylobacterium strains treated tomato and red pepper plants were lower than that of uninoculated treatment. Plants treated with Methylobacterium strains challenge inoculated with Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (XCV) and Ralstonia solanacearum (RS) showed significantly reduced disease symptom and lowered ethylene emission under greenhouse condition. The ACC and ACO (1-aminocyclopropane-1- carboxylate oxidase) accumulated in the tomato and red pepper leaves were significantly reduced with Methylobacterium spp. inoculation compared to treatment with pathogen alone. Ethylene level is ultimately reduced by reducing the biosynthetic precursor, ACC. Based on these results, Methylobacterium strains could be used to reduce disease symptoms in plants by lowering stress ethylene. In addition PR proteins related to ISR (Induced systemic resistance) including β-1,3-glucanase, PAL, PO and PPO were increased in Methylobacterium strain inoculated tomato and red pepper plants. This study supports that the Methylobacterium strains might increase the activity of defense enzymes by modulating the ethylene biosynthesis pathway, suggesting the possibility of using Methylotrophic bacteria as potential bio-control agents.
This study was performed to identify the effect of Methylobacterium, a growth inducing microorganism, on the growth of crops. Methylobacterium was transformed with gusA, nptII, and gfp genes and the stability of the introduced gene was confirmed. The genes were introduced with minitransposon and they were anchored on chromosome of microorganism. The stabilities of introduced genes were tested by colony PCR of the strains subsequently subcultured on antibiotics free medium. The transformed microorganism were treated to red pepper, rice, lettuce, tomato, and spinach. The location of the introduced microbes were analysed by confocal laser scanning microscopy (CLSM). The microbes were localized to roots of the crops and they enhanced the longitudinal growth of the roots of red pepper and lettuce. The effect of the microbe treatment on the gene expression of pathogenesis-related (PR) genes were studied. Microbes were treated to red pepper seeds and pathogens were treated at seedling stage. The expression of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) oxidase and phenylalanine ammonia-lyase (PAL) was analyzed using real-time PCR. The expression of the two genes were enhanced by the treatment of the microbes. In conclusion, Methylobacterium enhance the root growth of the treated crops and the microbe induce the expression of the pathogene resistant genes for produce anti-pathogenic substances.
To minimise the wastage of external application of organic and inorganic fertilizer, lime amendment for maintaining the pH, use of plant growth promoting bacteria (PGPB) in sustainable agricultural system is a focus area in 21stcentury crop production. Among the different PGPB, pink pigmented methylotrophic Methylobacterium has been investigated recently on many crop plants. In this paper, inoculation effect of Methylobacterium suomiense CBMB120-gfp29 on red pepper growth at different level of compost and lime amendment has been reporting. It was found that inoculation of M. suomiense CBMB120-gfp29 promoted plant height (0.96% to 24.76%) and dry matter accumulation (2.98% to 40.82%). Colonization study and leaf imprints confirmed the good colonization of the bacteria in red pepper plants.
However, no colonization was found for the 200% lime amendment. Large scale field experiment with the strains will lead to developed biofertilizer for sustainable crop production without disturbing the native population.
Fertilizers, plant growth promoting microbes and plant growth regulators should be combined together and used in order to achieve a maximal plant growth and yield in modern sustainable and ecological agricultural systems. In this study rhizosphere inoculation of Methylobacterium oryzae CBMB20 and foliar application of methanol were tested for their ability to promote the growth of red pepper plant at different levels of organic fertilizer. Rhizosphere inoculation of M. oryzae CBMB20 and foliar spray of methanol could promote red pepper plant growth and yield, and the growth promoting effect induced by the combined treatment of M. oryzae CBMB20 inoculation and foliar spray of methanol was more distinctive. This result suggests that a synergistic growth promoting effect of methanol spray and M. oryzae CBMB20 inoculation can be obtained in the combined treatment of the two growth promoting factors. The growth promoting effect was more significant in the lower fertilization rate, and the plant growth was not significantly different between 100 and 300% fertilizer treatments where both M. oryzae CBMB20 inoculation and foliar spray of methanol were included. This result indicates that, with the plant growth promoting effect of M. oryzae CBMB20 and methanol, fertilizer application rate can be profoundly reduced without any significant decreases in biomass accumulation and yield of crops.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• CONTENTS ... 11
• 목차 ... 12
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 13
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 19
• 제 3 장 연구개발내용 및 결과 ... 22
• 제 1절 다기능 식물생장촉진 미생물의 효능 규명 및 육묘 이용 방법 개발 ... 22
• 제 2절 표지를 통한 접종 미생물의 검정과 작물 내 분포와 내성관련 유전자 발현 규명 ... 115
• 제 3절 생물비료를 이용한 건전육묘 생산 기술 확립 ... 175
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 196
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 201
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 202
• 제 7 장 참고문헌 ... 217
• 끝페이지 ... 220