보고서 정보
주관연구기관 |
조선대학교 Chosun University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2012-05 |
과제시작연도 |
2011 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO201400026610 |
과제고유번호 |
1545002874 |
사업명 |
생명산업기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-11-14
|
DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201400026610 |
초록
▼
○ 연구결과
독자적으로 분리한 신규 토양세균을 이용,가축사료에 첨가하는 항생제 대체물질을 개발하여 차세대의 가축 질병예방.치료 및 사료효율 개선제로의 산업화를 목표로 사업을 진행한 결과는 다음과 같음.
1.Nocardiasp.CS682의 최적 발효조건 및 CS682분리공정 개발
1L flask에서의 실험결과,탄소원으로는 maltose,glucose가 가장 적합한 것으로 확인되었으며,질소원으로는 soybeanmeal(3.5%)일 때가 최적의 조건임을 확인되었음.7L Fermentor에 inoculm size를 4%(v
○ 연구결과
독자적으로 분리한 신규 토양세균을 이용,가축사료에 첨가하는 항생제 대체물질을 개발하여 차세대의 가축 질병예방.치료 및 사료효율 개선제로의 산업화를 목표로 사업을 진행한 결과는 다음과 같음.
1.Nocardiasp.CS682의 최적 발효조건 및 CS682분리공정 개발
1L flask에서의 실험결과,탄소원으로는 maltose,glucose가 가장 적합한 것으로 확인되었으며,질소원으로는 soybeanmeal(3.5%)일 때가 최적의 조건임을 확인되었음.7L Fermentor에 inoculm size를 4%(v/v)로 하여 접종하고 산소공급은 1vvm 공급하면서 배양시간별 발효정도를 조사하였음.CS682 는 3일 배양 시 최고조에 이르렀으며 그 후는 점차적으로 감소함을 확인함.500L Fermentor에서는 Maltose0.5%,Oatmeal0.25%,Soybeanmeal0.25%,Yeastex0.25%,Calcium carbonate0.05% 배지에서 28℃,0.5vvm,150rpm의 조건으로 배양 하였으며 Nargenicin의 생산량은 20시간에 증가하기 시작하였으며 50시간부턴 활성이 일정하였음.pH는 약 7에서 시작하여 9.05까지 배양 기간 동안 서서히 증가하였음.5톤 Fermentor에서는 Maltose0.5%,Oatmeal0.25%,Soybeanmeal0.25%,Yeastex 0.25%,Calcium carbonate0.05% 배지에 28℃,0.5vvm,75rpm 조건으로 배양함.배양에 접종한 seed는 50L 발효기에서 30L의 발효액을 96시간 배양 후 500L발효기로 접종하였으며 접종 후 온도,용존산소량,산소공급 및 교반속도를 유지하며 배양함.약 3일 배양 후 발효액을 5톤 발효조로 이동시키고 5톤 발효조건하에서 배양 기간동안 24시간에 1-2회 배양액을 채취하여 생산된 Nargenicin의 항MRSA활성을 측정하고 작동조건 및 pH변화를 모니터링한 결과 48~60시간 배양시 항균활성이 좋음을 확인하였음.
2.고효율의 대량 분리정제 공정 개발
NocardiaspCS682균주를 OSYM 액체배지에서 배양하여 원심분리하고 배양여액을 회수한 뒤filtration하였음.배양여액 20L를 50% Dichloromethane으로 2회 추출하여 얻은 추출액을 감압 농축하고 약 20ml의 MeOH로 녹여 이 시료를 MeOH로 평형시킨 sephadexLH-20gel로 충진된 column(2.5×110㎝)에 적하하여 chromatography를 실시하였음 (용출속도:50ml/h,분획 용량:10ml, 용출용매:MeOH).SephadexLH-20columnchromatography에 의해 항 MRSA 활성이 1 peak로 나타났으며,활성을 보이는 분획물을 모아 농축건조시켰음.농축건조시료를 소량의 ethylacetate에 녹인후 기존의 prep-TLC 대신에 Silicagelcolumnchromatography를 실시하여 (용출 용매,hexane:ethylacetate=2.5:1)CS682의 회수율을 기존방법보다 1.5배 향상시켰음.
3.CS382,유도체,CS382발효액,부분 정제물의 생물학적 활성 검증
- CS682는 분화를 유도하고 또한,분화 유도제인 ATRA나 1,25-(OH)2D3와 병행하여 처리하였을 때 분화유도의 증강에 효과적임.
→1,25-(OH)2D3와 함께 처리하면 monocyte/macrophage로 ATRA와 함께 처리하면 granulocyte로 백혈병 세포가 분화함
- CS682는 소교세포의 활성을 증가시키는 LPS에 의한 손상 (NO와 NO생성관 관련된 iNOS 발현, IL-1β,IL-6,TNF-α의 생성 감소)을 억제시킴
-CS682는 항산화 활성을 나타내지 않음.
-CS682는 대부분의 세포주에서는 항암활성을 나타내지 않았지만 폐암세포주에서 항암활성을 나타냄.
-CS682는 proinflammatorycytokine인 Th-1typecytokine(IL-2,IL-12,IFN-γ)의 분비를 증가시켜 세포매개성면역반응 촉진,anti-inflammatorycytokine인 Th-2cytokine(IL-6,IL8)의 분비를 억제시켜 체액성 면역반응을 억제시킴.
- CS682는 산화적 스트레스에 의한 간세포 손상에 대해 보호 효과(ALT,LDH 분비량 감소 활성산소생성 감소 및 HO-1의 발현량 증가)를 나타냄
4. 신규 CS682유도체 확보
-상업적으로 구입 가능한 D-mannitol과 acetol을 대상으로 가장 문제시 되는 선택적인 보호반응,축합 반응,탈보호반응 ester화 반응을 함을 통해 확인 하였으며,위의 반응 조건을 적용하여 CS682를 대상으로 selectivemonosilyationesterification이 성공적으로 이루어짐을 확인
-2-deoxy당을 실험실적으로 합성한 후 CS382와 축합
-축합전 glucose의 수산기를 보호,축합반응 진행함
-당에 불소를 도입한 후 CS682에 축합
5. 돌연변이와 생합성 유전자 조절을 통한 균주 개량
-생합성 유전자집단의 안정적 발현을 위해서 먼저 방선균에서 사용되고 있는 여러 가지 벡터를 사용하여, Nocardia에서의 안정적 발현을 위해 벡터 개발
-E.coli에서 대부분의 유전자 조작 후 Nocardia로 transform 할 수 있도록 E.coli의 replication origin 으로 구성된 E.coli-Nocardiashuttlevector를 고안하여 개발
-CS682을 클론하기 위한 prolinesynthase유전자 확보
-CS682는 polyketide를 backbone으로 하고 있기 때문에 acetyl-CoA,malonyl-CoA가 전구체로 사용됨. 따라서 이러한 전구체의 생합성 유전자를 생산성 향상에 도움을 줄 수 있어 target유전자로서 PanK 유전자 PDH 및 ACC 유전자를 확보
-metK 및 asfR(조절기작 유전자), metK 및 asfR malonyl-CoA(ACC), metK 및 asfR malonyl-CoA(PCC)발현벡터 제작
6.가축(닭,돼지,소)을 이용한 소규모 농장 수준의 임상 시험(사양시험)
- 육계를 이용한 CS682의 기능성 검증 :초생추에서 CS682의 사료첨가는 생체대사에 영향을 미치지 않고,소화기 이상 증상을 유발하지도 않으면서 사료효율을 효과적으로 증가시키는 것으로 확인됨.
-랫드를 이용한 CS682의 경구투여 급성독성시험 :랫드에 CS682의 단회경구투여는 10ml/kg 이하의 용량에서 어떠한 부작용도 초래하지 않으며,최소치사량은 암수 모두 10ml/kg을 상회하는 것으로 나타남.CS682가 매우 안전한 물질이라는 것을 보여주며,사료첨가제로써 개발가능성을 제시해 주고 있음.
-이유자돈을 이용한 CS682의 기능성 검증 :CS682의 급여군은 대조군에 비해 체중이 다소 증가하였고,사료효율도 개선된 것으로 확인.
- 랫드를 이용한 CS682의 경구투여 아급성독성시험 :1,000mg/kg/day 이하의 용량으로 CS682의 반복 경구투여는 랫드의 일반증상과 체중,사료섭취량,안 및 요소견,혈액,혈청생화학,부검소견,장기중량 및 주요 장기의 조직병리에 어떠한 독성영향도 나타내지 않았음.시험결과는 CS682가 독성이 없는 안전한 물질이라는 것을 암시해주며,사료첨가제로서의 개발가능성을 제시.
-육성돈을 이용한 CS682의 기능성 검증 :육성기에 CS682의 단독 사료첨가는 폐사율과 도태율을 감소시키고 사료효율을 높였으며,비육기에도 폐사율과 도태율을 감소시켰고,출하 시에 도체성적을 높이는 효과를 나타내었음.
- 랫드를 이용한 CS682 순물질의 경구투여 급성독성시험 :랫드에 CS682 순물질의 단회경구투여는 2,000mg/kg 용량에서 일시적인 침울과 체중증가량의 억제를 유발하나 회복성이 인정되었으며,800mg/kg이하에서는 어떠한 부작용도 초래하지 않았음.
-마우스를 이용한 CS682순물질의 경구투여 아급성독성시험 :CS682순물질은 마우스에서 독성이 없는 안전한 물질임을 확인
- 마우스를 이용한 CS682순물질의 경구투여 급성독성시험 :CS682순물질의 단회 경구투여는 2000mg/kg 이상의 용량에서 사망을 초래하였으며,800mg/kg 투여용량에서 투여당일에 일시적으로 미약한 운동성 감소를 유발하였으나 특이적인 독성영향은 나타내지 않았음.본 시험조건하에서 마우스에 대한 CS682순물질의 반수치사량은 800mg/kg과 2000mg/kg사이로 확인.
7.시제품제작 및 참여기업이나 관련 기업으로의 기술이전 등을 통한 사업화
-CS682의 대량생산 후 동결건조작업하여 얻은 원료 분말은 시제품 “DCS682"의 생산에 사용하였으며 CS682의 발효는 한국생명공학 연구원에서 DCS682시제품 생산은 대한뉴팜(주)생산라인에서 수행하였음.
-CS682는 함량균일성을 고려하여 배산법을 이용하여 혼합하였으며 혼합 후 얻은 제품은 1kg 씩 차광기밀포장하였음.
-CS682의 물성,유동성은 양호하였으며 부원료 및 부형제와 배산 혼합 시 문제는 없었으며 함량균일성도 일정하였음.
Abstract
Ⅳ. Result
establishment of large scale fermentation and purification, synthesis of CS682 derivatives, development of multi-vector system and biosynthesis genes, stability confirmed with feed additives, technology transfer on company
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 3
- SUMMARY ... 11
- CONTENTS ... 13
- 목차 ... 17
- 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 21
- 제1절 연구 배경 ... 21
- 제2절 연구개발 목적 및 중요성 ... 22
- 1. 국내/국외 항생제 사용의 법적 규제 ... 22
- 2. 국내 항생제시장과 항생제대체물질 ... 22
- 3. 항생제 대체 물질의 요건 ... 24
- 4. 항생제대체물질의 개발과 천연자원 ... 24
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 26
- 제1절 국내외 관련분야 환경변화 ... 26
- 제2절 항생제 대체제의 국내/외 현황 파악 ... 29
- 1. 국내 항생제 대체제 사용 현황 ... 28
- 2. 국외 항생제 대체제 사용 현황 ... 33
- 3. 국내/외 항생제 대체제 관련 주요 기술연구 현황 ... 36
- 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 37
- 제1절. 제1세부 과제(발효 화합물의 대량 생산 및 항 미생물 활성 연구) ... 37
- 1. 균주 동정(일반적 특성분석) ... 37
- 2. 균주동정(유전적 특성 분석) ... 40
- 3. 균주동정 결과 ... 41
- 4. Nocardia sp. CS682의 최적발효 조건 ... 46
- 5. CS682의 분리공정개선 ... 49
- 6. scale-up process ... 50
- 7. 배양액의 농축 및 동결건조 ... 54
- 8. 안정성 시험 ... 59
- 9. CS682배양액에서 Nargenicin 분리정제공정 ... 60
- 10. 5톤 발효조 배양 ... 67
- 11. 소형발효조에서 foam 생성감소에 관한 연구 ... 68
- 12. 대량생산용 최적배지의 적합성 평가 ... 71
- 13. CS682 제품의 기준 및 시험방법 ... 78
- 14. DCS682 시제품 생산 ... 83
- 제2절 : 제2세부과제 (발효세균의 항암 및 면역활성 연구) ... 90
- 1. 연구방법 ... 90
- 1) 항산화 활성평가 ... 90
- 2) 세포 배양 ... 92
- 3) MTT assay를 이용한 세포 생존율 측정 ... 92
- 4) LDH assay/ALT assay 의한 세포독성 확인 ... 92
- 5) Hoechst 33324 staining에 의한 세포핵의 형태 관찰 ... 92
- 6) rhodamine 123을 이용한 mitochondria membrane potential 변화 측정 ... 93
- 7) Western blot ... 93
- 8) nitric oxide (NO) 생성량 측정 ... 93
- 9) Cytokine 농도변화 측정 (ELISA) ... 94
- 10) 활성산소종 측정 ... 94
- 2. 연구 결과 ... 94
- 1) CS682의 세포분화 유도효과 검정 ... 94
- 2) in vitro 항산화 효능 평가 ... 107
- 3) 항암효능 검증 ... 110
- 4) 면역증강효과검증 ... 114
- 5) 간세포 보호효과 검증 ... 120
- 제3절 : 제3세부과제 (발효화합물의 유도체 합성) ... 125
- 1. Model study-1 (선택적 보호반응, 선택적 탈보호반응, 선택적 부가반응, 선택적 전위반응) ... 125
- 2. 4-lipophilic pocket-2,3-dideoxycarbasugar의 합성 및 CS682와의 coupling ... 131
- 3. Glucose 와 CS-682와의 배당체 합성 ... 139
- 4. Fluorosugar 와 CS-682와의 배당체 합성 ... 142
- 5. Coupling of CS-682 with 5-membered heterocycles ... 146
- 6. Coupling of CS-682 with single, double and triple 5-membered heterocycles ... 151
- 7. Nargenicin 유도체 5종의 MTT assay(세포독성 확인) ... 166
- 8. Nargenicin 유도체 5종의 항염효과 측정(Nitrite Oxide Production) ... 168
- 9. Nargenicin 유도체 5종의 항염증 단백질 western blot ... 170
- 제4절 : 제1협동과제(CS682 발효물의 기능성검증 및 임상 독성 평가) ... 173
- 1. 육계를 이용한 CS682의 기능성 검증 ... 173
- 2. 랫드를 이용한 CS682의 경구투여 급성독성시험 ... 173
- 3. 이유자돈을 이용한 CS682의 기능성 검증 ... 174
- 4. 랫드를 이용한 CS682의 경구투여 아급성독성시험 ... 175
- 5. 육성돈을 이용한 CS682의 기능성 검증 ... 175
- 6. 랫드를 이용한 CS682의 순물질의 경구투여 급성독성시험 ... 175
- 7. 육성돈을 이용한 CS682의 기능성 검증 ... 176
- 8. 마우스를 이용한 CS682의 순물질의 경구투여 아급성독성시험 ... 177
- 9. 육계를 이용한 CS682 순물질의 기능성 검증 ... 177
- 10. 마우스를 이용한 CS682 순물질의 경구투여 급성독성시험 ... 183
- 제5절 : 제2협동과제 (CS682 고 생산균주 개발 및 사업화) ... 188
- 1. Nargenicin의 생합성 유전자의 클론 및 생합성 ... 188
- 2. Nargenicin의 고생산성 균주개량 ... 188
- 3. Proline feeding에 의한 isonargenicin의 생산 ... 190
- 4. Nargenicin의 생합성 유전자의 클론 ... 190
- 5. 대사공학에 의한 nargenicin 생산성 증가 ... 201
- 제6절 : 제3협동과제 (CS682 발효물의 사양시험) ... 216
- 1. 산란계 1차 사양시험 ... 216
- 2. 육계 사양 시험(cage) ... 224
- 3. 산란계 2차 사양 시험 ... 230
- 4. 육계 2차 사양 시험(Floor) ... 236
- 제 4 장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 241
- 제1절 목표 달성도 ... 241
- 제2절 관련분야에의 기여도 ... 246
- 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 248
- 제1절 연구개발 성과 ... 248
- 1. 논문 실적 ... 248
- 2. 특허 출원 ... 260
- 3. 특허 등록 ... 261
- 4. 학술대회 발표 ... 262
- 5. 기타 실적 ... 268
- 제2절 성과 활용 계획 ... 269
- 제 6 장 연구개발 과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 273
- 제 7 장 참고문헌 ... 279
- 부록 1. 논문 실적 ... 283
- 부록 2. 특허 ... 328
- 부록 3. 학술회의 발표 ... 351
- 부록 4. 분리동정한 균주의 기탁증 ... 387
- 부록 5. 기술이전 ... 388
- 부록 6. 수상 실적 ... 389
- 부록 7. DCS682 판매관련 자료 ... 391
- 부록 8. 언론홍보자료 ... 392
- 끝페이지 ... 393
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.