[보고서]단백질복구효소 Msr의 생화학

단백질복구효소 Msr의 생화학
Biochemistry of the protein repair enzyme Msr 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	영남대학교 YeungNam University
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2014-09
과제시작연도	2013
주관부처	미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning
등록번호	TRKO201400028792
과제고유번호	1711000786
사업명	중견연구자지원
DB 구축일자	2014-11-22
키워드	메치오닌 산화.글루타레독신.티오레독신.생화학 특성.구조 분석.재생 기작.단백질복구효소.셀레노단백질.methionine oxidation.glutaredoxin.thioredoxin.biochemical properties.structural analysis.Msr.regeneration.protein repair enzyme.selenoprotein.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201400028792

초록 ▼

연구결과
(1) MsrA 환원에서 Grx의 반응 메커니즘
- MsrA와 MsrB의 환원제로 Grx 기능 분석
- Grx-MsrA complex 구조 결정
- Grx-MsrA 반응에 대한 분자적 기전 해석
(2) Selenoprotein MsrA의 구조 및 생화학 특성 분석
- X-ray crystallography를 이용한 selenoprotein MsrA의 구조 결정
- 1-Cys type MsrA의 새로운 dimerization-의존적 반응 기작 규명
(3) Selenoprotein Grx1과 Cys-형태 Grx2의 구조 결정
- selenoprotein Grx1의 구조 및 특성 규명
- GSH- 및 GSSG-bound Grx2의 구조 결정
(4) Type II fRMsr의 생화학 특성 및 구조 분석
- Type II fRMsr 발현, 정제 및 다양한 생화학적 특성 분석
- Type II fRMsr 구조 결정 (reduced, oxidized, substrate-bound 형태) 및 비교
(5) MsrB/MsrA의 free methionine sulfoxide 환원 활성 분석
- Free Msr과 peptide Msr 활성에 대한 kinetic analysis
- Yeast를 이용한 in vivo free methionine sulfoxide 환원 활성 측정
(6) MsrAB의 생화학 특성 및 구조 분석
- MsrAB의 생화학 특성 분석: 3종의 MsrAB, MsrA, MsrB domain
- H. pylori MsrAB 구조 결정
(7) 세포성장에서 MsrA와 MsrB의 기능 규명
- 세포성장에서 MsrA의 heme oxygenase-1의 발현 조절 기능 규명
- 세포성장에서 MsrB3의 기능 규명

Abstract ▼

Result
(1) Regeneration mechanism of MsrA by Grx
- Biochemical analysis of Grx as a reducing agent for MsrA and MsrB
- Structural analysis of Grx-MsrA complex
- Molecular basis for the Grx-MsrA specificity
(2) Structural and biochemical analysis of selenoprotein MsrA
- Determination of structure of selenoprotein MsrA by X-ray crystallography
- Finding novel dimerization-dependent reaction mechanism of MsrA
(3) Structural analysis of selenoprotein Grx1 and Cys-containing homolog Grx2
- Structural characterization of selenoprotein Grx1
- Characterization of GSH- and GSSG-bound structures of Grx2
(4) Biochemical and structural analysis of type II fRMsr
- Biochemical analyses of type II fRMsr: kinetics, catalytic mechanism, etc
- Structural analysis of type II fRMsr (reduced, oxidized, and substrate-bound)
(5) Characterization of free methionine sulfoxide activities of MsrB and MsrA
- Kinetic analyses of free vs peptide Msr activities
- Establishment of in vivo free methionine sulfoxide reduction assay system
(6) Understanding of why the MsrA-MsrB fused protein (MsrAB) naturally occurs
- Kinetic analysis of MsrABs from 3 species: MsrA and MsrB domains and MsrAB
- Structural analysis of H. pylori MsrAB and MsrB domain
(7) The roles of MsrA and MsrB in cell proliferation
- Mechanistic study of MsrA function in expression of HO-1 in cell growth
- Functional role of MsrB3 in cell proliferation

표/그림 (44)

표 Kinetic analysis of 1-Cys (A) and 3-Cys (B) MsrAs for cGrx2.
표 Analysis of glutathionylation or deglutathionylation in various MsrA-Grx reactions by mass spectrometry. The protein bands indicated by arrows on the gel were subjected to MS analysis.
표 Complex formation between MsrA and Grx with disulfide bond.
표 Dissociation of MsrA-Grx by GSH
표 CoMsrA의 전체적인 구조
표 The active site of CoMsrA and its substrate recognition.
표 CoMsrA의 catalytic mechanism
표 Dimerization of CoMsrA in the presence of substrate.
표 Dimeric CoMsrA의 구조
표 Overall structure of cGrx2.
표 GSH and GSSG binding.
표 셀레노단백질 cGrx1의 구조
표 (A) E. coli Grx3, Trx1과 Grx1의 겹침 그림. (B) E. coli Grx1, Trx1을 Grx2와 겹침 그림. (C) Grx1, Grx2, EcTrx1, EcGrx3의 sequence alignment. CXXC motif는 잘 보존되어 있음.
표 (A) 알려져 있는 yeast MsrA와 Trx2의 복합체 구조 (JBC, 2010). (B). 이를 토대로 모델링한 SeMsrA-SeGrx1 또는 SeMsrA-Trx2 복합체 구조.
표 MsrA-Trx2의 복합체 구조를 토대로 모델링한 CoMsrA-cGrx1, 또는 CoMsrA-Grx2 겹침 구조 그림.
표 MsrA-Grx1 정제 결과. Grx1 단백질 양이 상대적으로 MsrA 의 단백질 양보다 적어 MsrA의 dimer 와 monomer 형태가 관찰 되었으나, 18% SDS-PAGE를 통해 MsrA-Grx1 complex를 확인하여 분리. Grx1 단백질의 size에서 peak 이 관찰되지 않은 것으로 보아 Grx1단백질이 모두 complex 형성에 참여했음을 확인.
표 MsrA-Grx1 복합체의 결정. 결정조건은 0.1M sodium phosphate/citric acid pH 4.2, 0.4M potassium phosphate(dibasic)/1.6M sodium phosphate(monobasic).
표 X-ray data collection and refinement statistics
표 MsrA-Grx1 complex 단백질의 overall structure.
표 MsrA-Grx1 complex 구조의 모식화 그림
표 Kinetic analysis of free Msr activities of mammalian MsrBs and MsrA
표 Kinetic parameters of free and peptide Msr activities
표 Western blot analysis (A) and measurement of peptide Msr activity (B) of recombinant MsrAs and MsrBs in yeast cells. Cell extracts were prepared from S. cerevisiae cells deficient in msrA/msrB/fRmsr genes and containing p425 vector only or indicated Msr constructs cultured for 2 days in YNBD medium containing Met. Peptide Msr activity from cell extracts was measured in DTT-dependent reaction using HPLC analysis. EV, p425 empty vector; MsrB2, mouse MsrB2; MsrB3, human MsrB3; fRMsr, S. cerevisiae fRMsr; yMsrB, S. cerevisiae MsrB; yMsrA, S. cerevisiae MsrA; ND, not detectable.
표 Growth complementation assays. Cell growth of triple msrA/msrB/fRmsr-deleted S. cerevisiae cells containing p425 vector only or indicated Msr constructs was analyzed in the Met (left) or Met-(R,S)-O (right) medium via serial dilution. The spotted cells were incubated at 30°C.
표 Kinetic parameters of wild-type and mutant forms of T. acidophilum fRMsr
표 Growth complementation assay.
표 A protective role of type II fRMsr against oxidative stress
표 Free thiol content in wild type and mutant forms of fRMsr
$X-ray diffraction data collection and refinement$ 표 X-ray diffraction data collection and refinement
표 T. acidophilum fRMsr (TafRMsr) overall structure.
표 SDS-PAGE analysis of purified HIMsrA. Lane M, markers (labelled in kDa); lane 1, purified HIMsrA after two-step purification.
표 Data-collection statistics.
표 HpMsrAB(24-359) 단백질의 발현 및 수용성 테스트 결과. BL21 competent 세포 내에서 두 개의 백터 모두 수용성 단백질이 과발현 됨.
표 SDS-PAGE analysis of purified HpMsrAB(24-359).
표 Crystallization screening에서 생긴 결정.
표 Crystallization optimization 결과
표 Kinetic parameters of Helicobacter pylori MsrAB
표 Kinetic parameters of HiMsrAB, HiMsrA, and HiMsrB
표 Down-regulation of MsrA induces HO-1 expression. NIH3T3 cells were infected with recombinant adenoviruses at an MOI of 50 for 72 h
$MsrA depletion increases nuclear accumulation of Nrf2. NIH3T3 cells were infected with MsrA-knockdown (Ad-siMsrA) or control (Ad-Con) adenoviruses at an MOI of 50 for 48 or 72 h. Cytosolic and nuclear proteins were fractionated.$ 표 MsrA depletion increases nuclear accumulation of Nrf2. NIH3T3 cells were infected with MsrA-knockdown (Ad-siMsrA) or control (Ad-Con) adenoviruses at an MOI of 50 for 48 or 72 h. Cytosolic and nuclear proteins were fractionated.
표 MsrB3 deficiency leads to decreased MEF cell proliferation. Cells (passage 3) were cultured for 72 h (A-B) and for the indicated times (C).
표 MsrB3 deficiency increases protein levels of p53, p21, and p27. MEF cells (passage 4) cultured for 48 h were subjected to Western blot analysis. WT, wild-type; KO, MsrB3 knockout.
표 MsrB3 deficiency causes cell cycle arrest at G1. MEF cells (passage 5) were cultured for 48 h.
표 MsrB3 knockdown in HDF cells decreases cell growth and activates the p53-p21 and p27 pathways. The transfected HDF cells were cultured for 48 h (A-C and E) and for the indicated times (D).

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