[보고서]오믹스 기반 삼일열원충 유성생식기 특이 단백질 대단위 발굴을 통한전파 차단 백신 후보물질 도출 연구

[국가R&D연구보고서] 오믹스 기반 삼일열원충 유성생식기 특이 단백질 대단위 발굴을 통한전파 차단 백신 후보물질 도출 연구
Omics-based mass identification of Plasmodium vivax proteins expressed in sexual life cycle for transmission blocking vaccine candidates 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	인하대학교 InHa University
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2014-09
과제시작연도	2013
주관부처	미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO201400028826
과제고유번호	1711000934
사업명	중견연구자지원
DB 구축일자	2014-11-22
키워드	말라리아.삼일열원충.유성생식기.유전체학.단백체학.전파 차단 백신.클로닝.재조합 단백질.매개모기.Malaria.Plasmodium vivax.Sexual life cycle.Genomics.Proteomics.Transmission blocking vaccine.Cloning.Recombinant protein.Anopheles spp..
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201400028826

초록 ▼

연구결과
(1) 매개 모기 인공배양법 확립과 삼일열원충 유성생식기 특이 발현 유전자/단백질 발굴
○ 삼일열원충 매개 모기의 인공사육 및 인공 감염법 확립
○ 단백체 기법을 활용한 유성생식기 삼일열원충 특이 단백질 발굴
○ 유전체 연구를 통한 유성생식기 삼일열원충 특이 발현 유전자 발굴
(2) 삼일열원충 유성생식기 특이 단백질의 재조합 단백질 생산과 특성 분석
○ 삼일열원충 매개 모기의 인공 감염 효율 향상 연구
○ 유성생식기 삼일열원충 특이 발현 유전자 클로닝과 유행주 내 유전적 변이 분석
○ 유성생식기 삼일열원충 특이 발현 단백질의 재조합 단백질과 특이 항체 생산
○ 유성생식기 삼일열원충 특이 단백질의 생화학적/면역학적 특성 분석
(3) 삼일열원충 전파차단 백신 후보 항원 및 주요 백신 항원의 유전적 변이 분석
○ 국내외 삼일열원충 분리주에서 전파차단 백신 후보 항원 유전자(Pvs25, Pvs28, Pvs48/45, PvWARP, PvSOAP 및 PvTRAP)의 유전적 변이 분석
○ 국내외 삼일열원충 분리주에서 주요 백신 후보 항원 유전자(PvMSP-1, PvMSP-3α, PvMSP-β, PvDBPII)의 유전적 변이 분석
(4) 삼일열원충 유성생식기 특이 단백질의 특성 분석과 전파 차단 백신 후보물질로서 효능 평가
○ 유성생식기 삼일열원충 특이 단백질의 생화학적/면역학적 특성 분석
○ 새로운 삼일열원충 전파 차단 백신 후보물질 도출

Abstract ▼

Result
(1) Establishment of Anopheles sinensis in vitro culture and identify of specific gene/protein expressed in sexual life cycle
○ Establishment of Anopheles sinensis in vitro culture and laboratory infection methods
○ Proteomic analysis of proteins of P. vivax proteins expressed in sexual life cycle
○ Genomic analysis of P. vivax genes expressed in sexual life cycle
(2) Production and characterization of biochemical and immunological properties of P. vivax proteins expressed in sexual life cycle
○ Improvement of infection ratio of Anopheles sinensis in vitro
○ Cloning of genes expressed in sexual life cycle and analysis of genetic polymorphism
○ Production of recombinant protein and specific antibody
○ Characterization of biochemical and immunological properties of P. vivax proteins expressed in sexual life cycle
(3) Analysis of genetic polymorphism of the proteins for transmission blocking vaccine and vaccine candidates
○ Analysis of genetic polymorphism of transmission blocking vaccine candidate proteins (Pvs25, Pvs28, Pvs48/45, PvWARP, PvSOAP and PvTRAP)
○ Analysis of genetic polymorphism of vaccine candidate proteins (PvMSP-1, PvMSP-3α, PvMSP-β, PvDBPII) isolated from Korea and outside
(4) Characterization of proteins expressed in sexual life cycle and evaluate the potentials of the proteins as transmission blocking vaccine candidates
○ Characterization of biochemical and immunological properties of P. vivax proteins expressed in sexual life cycle
○ Identification of novel proteins of transmission blocking vaccine candidates

표/그림 (69)

표 열원충의 생활사. (A) 열원충의 생활사 모식도. (B) 인체 감염 열원충의 적혈구기 생활사.
표 우리나라 말라리아 발생 현황. (A) 연간 발생 현황. (B) 지리적 분포.
표 말라리아 백신 개발 연구 분야 및 연구 진행 중인 백신 후보 물질들.
표 삼일열원충 유성생식기 특이 발현 후보 유전자 탐색.
표 선택된 유전자의 염기서열을 NCBI blostx search를 사용한 삼일열원충에서 유사 유전자 탐색
표 GenBank에서 선택된 유전자의 ID를 검색하여 확인된 삼일열원충 유전자의 정보와 단백질 아미노산 서열과 유전자 염기서열
표 성충 모기 채집을 위해 제작된 컵 (A)과 망사를 씌운 종이컵 (B)
표 모기사육 케이지
표 유충 사육용 vat(350 mm x 240 mm x 50 mm, A)와 모기 유충 및 번데기 채집 및 먹이제공용 스포이드(길이 150 mm, 구멍 지름 5 mm, B)
표 Oligonucleotide primers for Anopheles species identification
표 Oligonucleotide primers for nested PCR
표 Oligonucleotide primers for semi-nested PCR
표 삼일열원충 국내 분리주의 MSP-142의 염기서열의 변이 분석.
표 삼일열원충 국내 분리주 MSP-142의 nucleotide diversity와 자연선택 (natural selection) 분석.
표 국내 분리 삼일열원충의 Pvs25 유전자 분석.
표 국내 분리 삼일열원충 Pvs28 유전자의 변이 분석.
표 국내 분리 삼일열원충 Pvs48/45 유전자의 변이 분석.
표 국내 분리 삼일열원충 PvWARP 유전자의 변이 분석.
표 국내 분리 삼일열원충 전파 차단 백신 후보 항원 유전자의 유전적 변이 및 자연선택 분석
표 우리나라 삼일열원충의 PvMSP-3β 유전자 다양성.
표 우리나라 삼일열원충의 PvMSP-3β 유전자 다양성.
표 Coiled-coil 구조 분석. The five subtypes of PvMSP-3β sequences of Korean P. vivax showed a high probability of forming coiled-coils. The portions corresponding to insert A and insert B are marked with the blue or dotted red lines, respectively.
표 우리나라 삼일열원충의 PvMSP-3β의 자연선택 및 유전자 재조합 분석.
표 국내 분리 삼일열원충 PvMSP-3β 유전자의 유전적 변이 및 자연선택 분석
표 우리나라 삼일열원충 PvDBPII의 유전적 변이 분석.
표 계통발생학적 분석. The phylogenetic tree for the 13 haplotypes of PvDBPII was constructed with a neighbor-joining method using the MEGA4 program. Numbers on the branches indicate bootstrap proportions (1000 replicates).
표 우리나라 삼일열원충 PvDBPII의 유전적 변이 및 자연선택 분석
표 우리나라 삼일열원충 PvDBPII의 자연선택 분석.
표 B-세포와 T-세포 epitope부위의 변이 분석
표 미얀마 삼일열원충 PvDBPII의 유전적 변이 분석.
표 미얀마 삼일열원충 PvDBPII의 유전적 변이 및 자연선택 분석
표 계통발생학적 분석. The phylogenetic tree for the 12 haplotypes of PvDBPII was constructed with a neighbor-joining method using the MEGA4 program. Numbers on the branches indicate bootstrap proportions (1,000 replicates). Numbers on the branches indicate bootstrap proportions (1,000 replicates). The new haplotypes are marked with asterisks.
표 미얀마 삼일열원충 PvDBPII의 자연선택 분석.
표 삼일열원충 유성생식기 특이 발현 후보 유전자
표 삼일열원충 유성생식기 특이 발현 후보 유전자 PCR 증폭 결과.
표 Colony PCR 방법으로 pGEM-TA vector에 cloning된 Gamete antigen 27/25(1,125 bp), Plasmodium expert protein(PHISTb), unknown function(1,087 bp), CWP-WPC family protein(881 bp) 유전자 확인. pGEM-TA vector priming site 200 bp가 증가하였음. Lane 3; Gamete antigen 27/25, Lane 4-3; Plasmodium expert protein (PHISTb), unknown function, Lane 6-1; CWP-WPC family protein
표 Multiple sequence alignment of Pvs230 and other Pvs230 sequences from GenBank. Amino acid alignment was performed using Clustal W. P. vivax Sal-1 (Accession No. XM_001613322), P. vivax from Korea isolate (Accession No. ADD39016).
표 Signal peptide prediction of Pvs230. Signal peptide was predicted using SignalP-4.1. Signal peptide was predicted at N-terminus with cleavage sites between amino acid 21 and 22.
표 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of Pvs230N (A) and TA-cloning into pGEM-TA vector (B). Plasmid were digested with restriction endonuclease EcoRI.
표 Agarose gel electrophoresis of subcloning of Pvs230N into pRSET-B vector. Plasmid were digested with restriction endonuclease BamHI and HindIII.
표 12.5% SDS-Poly-acrylamide gel electrophoresis of Pvs230N recombinant protein expression. Recombinant protein was expressed as an insoluble protein form.
표 Western blotting of purified Pvs230N recombinant protein.
표 12.5% SDS-Poly-acrylamide gel electrophoresis of purified recombinant Pvs230N protein
표 Result of fusion plate screening for Pfs230N monoclonal antibody by ELISA
표 Interpretation of anti-Pvs230N monoclonal antibody. All two antibody are IgG1 and kappa chain.
표 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of PvMAOP-5H and PvMAOP-3H.
표 Agarose gel electrophoresis of PvMAOP-5H and PvMAOP-3H in pGEM-TA vector (B). Plasmid were digested with restriction endonuclease EcoRI.
표 Agarose gel electrophoresis of subcloning of PvMAOP-5H and PvMAOP-3H into pRSET-C. Plasmid were digested with restriction endonuclease BamHI and XhoI (PvMAOP-5H) and Xho I and Hind III (PvMAOP-3H).
표 12.5% SDS-Poly-acrylamide gel electrophoresis of PvMAOP-5H recombinant protein expression. Recombinant protein was expressed as an insoluble protein form.
표 12.5% SDS-Poly-acrylamide gel electrophoresis of PvMAOP-3H recombinant protein expression. Recombinant protein was expressed as an insoluble protein form.
표 Western blotting of purified PvMAOP-3H recombinant protein.
표 12.5% SDS-Poly-acrylamide gel electrophoresis of purified recombinant PvMAOP-5H protein
표 12.5% SDS-Poly-acrylamide gel electrophoresis of purified recombinant PvMAOP-3H protein
표 우리나라 삼일열원충 PvSOAP의 유전적 변이 분석. The PvSOAP was amplified from P. vivax isolates collected in Korea(n=20), Myanmar(n=10), and Uganda(n=5). The deduced sequence of each sample was aligned with the sequence of Sal I(PVX_086220).
표 재조합 PvSOAP의 발현 및 정제. The gene of PvSOAP was cloned into pQE-30 expression vector and transformed into E. coli M15[pREP4]. Expression of the recombinant protein was induced with 1 mM IPTG at 37℃ for 3 h. The recombinant protein was purified with Ni-NTA affinity column and analyzed by 15% SDS-PAGE. Lane M, protein size marker; lane 1, purified recombinant PvSOAP.
표 유문등을 이용한 성충 매개 모기의 채집
표 모기 사육 시설 구축. 온도 및 광도 조절 (A), 습도 조절 (B) 및 채집된 모기의 feeding을 위한 설탕물이 적셔진 탈지면 (C)
표 모기 유충 사육 시설. 유충의 먹이 (A)와 다양한 형태 및 크기의 용기 (B, C).
표 모기 유충 사육. 4령기 유충 (A), 번데기 (B, C)
표 모기 성충 사육 시설. 습도 유지를 위한 젖은 수건 (A)과 우화한 성충(red circle) (B)
표 모기 성충의 흡혈. 철망으로 단단히 고정시킨 마우스(mouse), 저빌(jerbil) 또는 렛트(rat)를 케이지 내의 중간 부분에 매달아 암컷 모기에게 흡혈을 유도하였음
표 중국얼룩날개모기 유충 사육. 3령기 유충 (A), 4령기 유충 (B), 번데기로 변하기 시작함 (C)
표 중국얼룩날개모기 성충의 사육. 우화한 성충을 사육케이지로 옮긴 후 (A, B) 자연 교미를 유도(red arrow)하였고 (C), 교미 후 암컷모기의 알의 성숙을 위해 혈액을 제공하였음 (D)
표 삼일열원충 인공 감염 실험을 위한 인공 막 흡혈 기구
표 축사에서 포획한 중국얼룩날개모기 (A)와 집모기 (B).
표 야외에서 채집한 얼룩날개모기 유충.
표 해부현미경으로 동정된 중국얼룩날개모기(An. sinensis)의 날개.
표 Agarose gel electrophoresis of PCR for Anopheles spp. identification. (A) An. sinensis. (B) An. lesteri. (C) An. pullus.
표 Agarose gel electrophoresis of nested PCR for detection of P. vivax sporozoite. P; Positive control, N; Negative control, DW; Distilled water.

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