초록 ▼

연구의 목적 및 내용
본 과제의 최종 목표는 신개념의 등온/정량 핵산 증폭 핵심 기술을 개발하고 이 기술을 이용하여 핵산뿐 아니라 단백질과 small molecule 등을 등온조건에서 간편하게 초고감도로 분석할 수 있는 현장진단 시스템의 원천 핵심기술을 개발하는 것이다. 본 과제에서는 본 연구팀이 보유하고 있는 여러 가지 분자생물학 효소들(DNA polymerase, RNAse H, Nicking enzyme)에 대한 경험과 핵산기반 활성 분자들 (DNAzyme, Aptmer) 등에 대한 기술력을 조합하여 독자적인 최첨단 등온

연구의 목적 및 내용
본 과제의 최종 목표는 신개념의 등온/정량 핵산 증폭 핵심 기술을 개발하고 이 기술을 이용하여 핵산뿐 아니라 단백질과 small molecule 등을 등온조건에서 간편하게 초고감도로 분석할 수 있는 현장진단 시스템의 원천 핵심기술을 개발하는 것이다. 본 과제에서는 본 연구팀이 보유하고 있는 여러 가지 분자생물학 효소들(DNA polymerase, RNAse H, Nicking enzyme)에 대한 경험과 핵산기반 활성 분자들 (DNAzyme, Aptmer) 등에 대한 기술력을 조합하여 독자적인 최첨단 등온/정량 핵산 증폭기술을 개발할것이다. 특히 Nicking enzyme을 이용한 등온/정량 핵산 증폭기술은 단백질 면역 측정법에 융합시켜 기존의 면역측정법으로 진단할 수 있는 바이러스, 박테리아, 항원, 항체 등을 초고감도로 현장에서 진단할수 있는 기술을 개발할 것이다. 또한 압타머 (aptamer) 분자를 이용한 등온/정량 핵산 증폭기술을 개발하여 생체조절인자 등의 고감도 진단기술을 개발할 것이다. 종합적으로 본 과제의 최종 목표는 독자적인 등온/정량 핵산 증폭기술을 개발하고 이 기술을 기반으로 핵산뿐 아니라 단백질과 생체조절인자 등을 초고감도로 현장에서 간편하게 진단할 수 있는 분석 시스템을 개발하는 것이다.

연구결과
핵산, 단백질, small molecule 등을 고감도로 진단할 수 있는 신개념의 등온/정량 핵산 증폭기술들을 개발하고 이를 이용하여 각각의 목적 물질들을 고감도로 현장진단(POCT: point of care testing)할 수 있는 시스템을 개발한다.
1. RNAse H와 displacement DNA polymerase의 효소 특성을 이용하여 고감도 및 고특이성 등온 핵산 증폭기술(ICA: Isothermal Chain Amplification) 개발
2. ICA 기술과 CPT(Cycling Probe Technology) 기술을 접목하여 실시간 등온/정량 증폭기술 iTPA(Isothermal Target & Probe Amplification) 개발
3. 핵산 현장진단 시스템 구축을 위한 iTPA(Isothermal Target & Probe Amplification) 기반 핵산발색 진단 기술 개발
4. 빠른 시간에 높은 증폭 효율을 보이는 새로운 개념의 등온 핵산증폭방법인 EXPAR (EXPonential Amplification Reaction)의 개발
4-1. EXPAR 기반 고감도 면역검출법의 개발
5. 등온/정량 핵산증폭을 통한 단백질 검출기술 개발 본 연구팀 고유의 NEIA(Nicking Enzyme-based Isothermal Amplification) 방법을 이용하여 단백질 등을 고감도로 대량 진단하는 기술을 개발한다.
5-1. 특정 염기서열을 인식한 후 DNA의 한 쪽 가닥만을 특이적으로 자르는 효소인 nicking enzyme 과 치환활성이 있는 DNA 중합효소를 이용하여 특정 염기서열을 등온에서 반복적으로 복제해내는 새로운 개념의 등온증폭 기술을 개발하고 이를 기존의 면역측정 시스템에 융합시킨다.
5-2. NEIA 방식을 통해 생성된 단일 가닥 DNA 를 MALDI-TOF MS 방식을 통해 분석한다. 이를 통해 새로운 다중 분석 시스템을 개발한다.
6. 등온/정량 핵산증폭을 통한 생체조절인자(small molecule) 및 단백질 검출기술 개발
6-1. Aptamer의 구조적 변화 특성을 이용하여 새로운 개념의 핵산 등온 증폭기술을 개발하고 aptamer의 결합 특성을 이용하여 생체조절인자 등의 small molecule 이나 단백질을 고감도로 진단 할 수 있는 APIA(APtamer based Isothermal Amplification) 시스템을 개발한다.

연구결과의 활용계획
본 연구 과제는, 생명공학 분야에서 현재 큰 시장을 형성하고 있는 체외진단의 핵심기술인 독자적인 핵산 증폭 원천기술을 개발하는 것이다. 특히 향후 체외진단 시장을 지배하리라고 기대되는 현장진단을 위해서 필수적인 등온/정량 증폭 기술을 개발하는 것이다. 본 연구팀이 그동안의 집중적인 핵산 관련 연구 경험과 풍부한 관련 선행연구를 기반으로 핵산진단뿐 아니라 기존의 면역측정법도 대체할 수 있는 고감도의 실시간 진단 핵심 원천기술을 확보하게 되어 현장진단검사 (POCT) 시장에서 새로운 영역을 개척하고, 주도권을 확보할 수 있을 것이다. 특히 핵산진단과 면역측정 시장은, 약 60조원의 전체 체외진단 시장의 30% 이상을 차지하고 있는 매우 큰 시장이므로 원천 기술의 개발은 기술적, 경제적으로 큰 파급효과를 가질 것으로 기대된다.

Abstract ▼

Purpose&contents
The main objective of this research work involves development of novel isothermal/quantitative nucleic acid amplification methods in order to detect nucleic acids, proteins or small molecules etc. This can serve as a key technology for the development of ultra-high sensitive poin

Purpose&contents
The main objective of this research work involves development of novel isothermal/quantitative nucleic acid amplification methods in order to detect nucleic acids, proteins or small molecules etc. This can serve as a key technology for the development of ultra-high sensitive point-of-care-testing (POCT) system in molecular diagnostics. In particular, the efforts will be focused on development of simple, specific and sensitive immunoassay techniques for detection of viruses, bacteria as well as various antibody- antigen interactions with help of nicking enzyme in isothermal/quantitative nucleic acid amplification method. The goal of the proposed research can be achieved by crucial combination of experimental techniques and various molecular enzymes with the nucleic acid-based active molecules. It is also aimed to utilize the high selectivity of different aptamers in designing the novel nucleic acid amplification protocol for the ultra-high sensitive diagnosis of nucleic acids or small molecules.

Result
Designing of novel isothermal/quantitative nucleic acid amplification method will facilitate the development of ultra-high sensitive POCT technique for the detection of nucleic acids, proteins, or small molecules.
1. Isothermal Chain Amplification (ICA): This is an isothermal amplification method based on DNA-RNA chimeric primer and RNAse activity. This method can specifically cleave RNA strands in DNA/RNA duplex by the activity of DNA polymerase.
2. Cycling Probe Technology (CPT): This is a quantitative amplification method based on fluorescence signal generated due to the cleavage of RNA fraction in CPT probe by RNAse H in the presence of the isothermally amplified target DNA. A synergistic effect of both the above amplification methods will lead to a novel POCT system for the nucleic acid detection.
3. The colorimetric diagnosis technique based on iTPA(Isothermal Target & Probe Amplification) is developed for a POCT system.
4. EXPonential amplification reaction (EXPAR) method is developed, which will be modified and applied further for the sensitive diagnosis of proteins in the following manner:
4-1. A specific DNA sequence is rapidly and exponentially amplified by a new isothermal amplification method utilizing both nicking enzyme (which cleave specific sequence of single-stranded DNA) and DNA polymerase (which has displacement activity).
4-2. Based on EXPAR, a novel and sensitive immunoassay technique is developed.
5. NEIA (Nicking Enzyme-based Isothermal Amplification) is developed for the highly sensitive detection of proteins.
5-1. Based on NEIA, the generated single-stranded DNA is detected with MALDI-TOF MS as well as fluorescence spectrophotometer.
6. An aptamer-based isothermal amplification (APIA) strategy is developed for the amplification of nucleic acids. The highly specific structural properties and selective affinities of the aptamers allow nucleic acids to be amplified at a constant temperature without the thermal denaturation step.

Expected Contribution
Detection methods based on nucleic acid amplification play a crucial role in clinical diagnostics and biosensing. Herein, we developed a novel method for nucleic acid amplification, which can serve as a basis for the development of ultra-sensitive POCT system for nucleic acids, proteins or small molecules detection. Considering the increasing market share of POCT in in-vitro diagnostics (IVD), the development of a new isothermal/quantitative nucleic acid amplification technique is necessary due to its indispensable nature. The developed technique will overcome the limitations of current techniques both technically and economically and be applied to the nucleic acid diagnosis and immunoassay field, which has a huge market in the IVD with more than 40 billion US dollars.